1-4-3- مشخصات توالي ژن PFK-131
2-4-3- طراحي پرايمرها35
3-4-3- آماده سازي پرايمر35
5-3- استخراج RNA:36
1-5-3- استخراج RNA از نمونه هاي تازه کبد توسط کيت Geneall Hybrid Rtm36
1-5-3- بررسي کميت و کيفيت RNA استخراج شده38
6-3- سنتز cDNA39
1-6-3- سنتز cDNA توسط کيتThermo SCIENTIFIC39
7-3- واکنش هاي PCR41
1-7-3 – PCR شيب دمايي41
2-7-3- PCR معمولي43
8-3- الکترفورز45
1-8-3 – مواد مورد نيازجهت تهيه ژل الکتروفورز45
1-1-8-3- آگارز45
2-1-8-3- اتيديوم برومايد46
3-1-8-3- لودينگ بافر46
4-1-8-3-طرز تهيه محلول Tris-Hcl46
4-1-8-3- شناساگرهاي اندازهDNA47
9-3- روش کار با ژل الکترفورز47

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

10-3- رسم منحني استاندارد:48
10-3- واکنش Real-Time PCR48
11-3- Threshold و مقدار CT:50
12-3- تعيين توالي محصولات (Direct Sequencing) PCR51
10-2-3- آناليز بيان ژن52
13-3- تجزيه وتحليل داده ها52
فصل چهارم: نتايج و بحث
1-4- جمع آوري نمونه :54
2-4- بررسي نتايج وزن موشهاي مورد مطالعه54
3-4- بررسي نتايج گلوکز ناشتاي سرم موشهاي مورد مطالعه56
5-4- نتايج استخراج RNA:57
6-4- نتايج حاصل ازساخت cDNA بر روي ژل آگاروز59
7-4- نتايج تعيين غلظت و کيفيت RNA توسط اسپکتروفتومتري61
1-7-4- نتايج مربوط به PCR شيب دمايي61
8-4- نتايج منحني استاندارد62
1-8-4- منحني استاندارد ژن TBP63
2-8-4-منحني استاندارد ژن PFK-163
9-4- نتايج واكنش Real Time PCR64
1-9-4- تکثير ژنPFK65
2-9-4-تکثير ژن TBP66
10-4- ارزيابي کارايي تکثير ژنهاي مور مطالعه از طريق آناليز منحني ذوب:66
1-10-4- منحني تغييرات ذوب بر حسب دماي ژن PFK67
2-10-4-منحني تغييرات ذوب بر حسب دماي ژن TBP67
11-4- آناليز منحني ذوب ژن PFK68
12-4-آناليز منحني ذوب ژن TBP68
13-4- نتايج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روي ژل آگارز70
14-4- نتايج بررسي بيان ژن PK70
15-4- بحث:71
16-4- پيشنهادات73
منابع:75
جدول1-3- تجهيزات و دستگاهها26
جدول 2-3 پرايمرهاي طراحي شده35
جدول3-3- ليست اجزاي کيت استخراج RNA36
جدول 4-3 موادلازم براي PCR42
جدول 5-3 برنامه PCR شيب دمايي براي تکثير قطعه حاصل از TBP42
جدول 6-3 برنامه PCR شيب دمايي براي تکثير قطعه حاصل از PFK-143
جدول7-3 مواد مورد نياز براي تهيه بافر Tris-Hcl47
جدول8-3 مواد و ميزان مورد نياز براي يک واکنش در Real-Time PCR49
جدول9-3 مراحل، دما و زمان مربوطه در يک واکنش Real- time PCR براي ژن TBP50
جدول10-3- شرايط دمايي و زماني واکنش Real time PCR براي ژن PFK-150
شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکيناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان10
شکل2-1- فروکتوز 2-6 بي فسفات مهمترين فعال کننده آنزيم فسفوفروکتوکيناز 111
شکل3-1- مراحل گليکوليز12
شکل 1-3- نحوه گاواژ دادن عصاره28
شکل 2-3- تشريح موشها30
شکل 3-3- توالي ژن pfk-134
شکل 4-3- دستگاه اسپکتوفتومتري39
شکل 5-3 دستگاه PCR (Eppendorf -mastercyc gradient)44
شکل 6-3 دستگاه الکتروفورز وعکس ژل48
شکل 7-3 دستگاه Real-Time PCR49
شکل 1-4- فراواني موشهاي مورد مطالعه54
شکل 2-4- اثر مصرف عصاره هيدروالکلي برگ گياه جغجغه بر وزن موشهاي صحرايي55
شکل 3-4- اثر مصرف عصاره هيدروالکلي برگ گياه جغجغه بر گلوکز ناشتاي موشهاي صحرايي57
شکل 5-4- نتايج استخراج Total RNA59
شکل 6-4- تکثير قطعه (bp190)مربوط به ژن PFK.60
شکل7-4- تکثير قطعه (bp126) مربوط به ژن TBP.60
شکل 8-4- نتايج شيب دمايي PCR براي ژن PFK61
شکل 9-4- نتايج شيب دمايي PCR براي ژن TBP62
شکل 10-4- منحني استاندارد ژن TBP63
شکل11-4- منحني استاندارد ژنPFK64
شکل 12-4- منحني تکثيرژن PFK.65
شکل 13-4- منحني تکثيرژن TBP66
شکل 14-4 تغييرات فلورسانت بر حسب دما براي ژن TBP و PFK68
شکل 15-4- منحني ذوب ژن PFK و TBP69
شکل 16-4- عکس ژل براي ژن PFK1 نتايج حاصل از real- tim PVR70
شکل 16-4- تغييرات بيان ژن TBP70
1-1- مقدمه
ديابت يک بيماري ساده نيست، بلکه سندرم پيچيدهاي است که بارزترين ويژگي آن افزايش قند خون است. بنابراين، بيماران ديابتي هر چند در يک ويژگي به هم ميمانند، اما هم از نظر باليني و هم از نظر آسيب شناسي و ژنتيکي ناهمگون هستند. اين بيماري در سال 1980 ميلادي اين گونه تعريف شد: گروهي از نارساييها که ويژگي اصلي آنها افزايش بيش از اندازهي گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پيامد کمبود انسولين يا نارسايي در کارکرد انسولين و يا آميزهاي از اين دو است. عوارض ناشي از ديابت در 25% موارد، نارسايي کليه و در 50% موارد قطع عضو و نابينايي است (Tehranipour et al., 2008). گياهان دارويي از قديم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزايش کيفيت و طول زندگي در افراد ديابتي به کار گرفته شده است. با توجه به اين که گياهان دارويي نسبت به داروهاي شيميايي اثر جانبي کمتري دارند، بنابراين پژوهشگران به دنبال يافتن ترکيبهاي گياهي براي درمان و يا پيشگيري از اين بيماري هستند. گياه جغجغه (Prosopis farcta) گياهي با خواص ضد التهاب و ضد ديابتي است. اهميت فعاليت فسفوفروکتوکيناز 1 نه تنها از اين جنبه است که واکنشي به شدت انرژي زا را کنترل مي کند بلکه اولين مرحله در واکنشهاي گليکولايزيز است که واکنش يکطرفه بوده و برگشت ناپذير است. اين باعث ميگردد که کنترل شديدي بر روي ميزان گلوکز و ديگر مونوساکاريدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آيد.. هدف از مطالعه حاضر بررسي اثر عصاره هيدروالکلي برگ گياه جغجغه بر ميزان بيان ژن پيروات کيناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌هاي صحرايي نر ديابتي مي‌باشد.
2-1-کليات تحقيق
1-2-1-ديابت
ديابت مليتوس شامل بيماريهاي متابوليکي است که مشخصه آن افزايش مزمن قند خون و اختلالات متابوليسم کربوهيدراتها، چربيها و پروتئينها مي باشد. اين بيماري در نتيجهي وجود نقص در ترشح انسولين، عملکرد انسولين يا هر دو ايجاد ميگردد. افزايش مزمن قند خون در حالت ناشتا يا بعد از خوردن غذا مسئول عمدهي عوارض کوتاه اثر و بلند مدت اين بيماري مي باشد که تمام سيستمها و اندامهاي بدن را تحت تاثير قرار ميدهند. اين بيماري شايعترين علت بيماريهاي کليوي مرحله نهايي، موارد جديد نابينايي و قطع اندام تحتاني غيرترومايي را به خود اختصاص ميدهد. بيماري قلبي عروقي در افراد ديابتي 2 تا 4 برابر نسبت به افراد عادي شايعتر است و در افراد بالاتر از 25 سال 18? تمام بيماريها را شامل ميگردد.
2-2-1- انواع ديابت
ديابت به دو دستهي اصلي وابسته به انسولين (ديابت نوع 1) و ديابت غير وابسته به انسولين (ديابت نوع 2) تقسيم ميشود. همچنين گونه ديگر با نام ديابت بارداري (Gestational) که در دوران بارداري بروز کرده و پس از آن بهبود مي يابد.
در ديابت نوع 1 که از انواع شايع بيماريهاي خود ايمن است سيستم ايمني بدن سلولهاي? سازنده انسولين در پانکراس را تخريب ميکند. اين نوع ديابت بسيار سريعتر از ساير فرمهاي ديابت پيشرفت ميکند و معمولا در کودکان و نوجوانان بالغ، بعضي اوقات در جوانان بالغ ديده ميشود. اين بيماران بايد بطور منظم انسولين تزريق کنند. همچنين به اين ديابت، ديابت جوانان يا ديابت مليتوس وابسته به انسولين نيز ميگويند. اما اين اصطلاح نميتواند کاملا دقيق باشد براي اينکه اين کودکان ميتوانند به ساير فرمهاي ديابت مبتلا شوند. يک فرم ديگر از ديابت نوع 1 که در سنين بالا معمولا بعد از سي سالگي رخ ميدهد LADA1گفته ميشود. افراد مبتلا به اين نوع ديابت فاقد شاخصهاي ايمونولوژيکي هستند که حاکي از روند تخريب خود ايمني سلولهاي ? باشد با اين وجود اين بيماران بواسطهي مکانيسمهاي نامشخصي دچار کمبود انسولين ميشوند. گاهي اوقات بيماران مبتلا به ديابت اتوايميون به دليل افزايش وزن و فاکتورهاي ژنتيکي به انسولين مقاوم ميشوند به اين شرايط ديابت مضاعف2گفته ميشود.

فاکتورهاي قابل کنترلي مانند شيوه زندگي ناسالم، پرخوري، کم تحرکي، چاقي، ميتوانند توانايي بدن را در استفاده از انسولين مختل کنند. همچنين فاکتورهاي غير قابل کنترلي مانند ژنتيک، تاريخچهي خانوادگي ديابتي، سن نيز در اين فرايند درگيرند. فرمهاي متابوليک ديابت شامل ديابت بارداري و ديابت نوع 2 ميباشند. بيماري ديابت بارداري، فرم موقت ديابت است و در دوران بارداري در هر زن غيرديابتي ميتواند رخ دهد. تغييرات هورموني، همراه با وزن زياد و تاريچه خانوادگي ديابتي در ابتلا به اين بيماري نقش دارند. بر اساس گزارش موسسه آمريکايي ديابت حدود 4% از زنان در طول دوران بارداري به اين فرم از ديابت مبتلا ميشوند. اين بيماري ميتواند مشکلاتي مانند تولد جنين نارس، يرقان و مشکلات تنفسي براي مادر و کودک ايجاد کند. اين بيماري بعد از زايمان بهبود مييابد ولي مادر و کودک در سنين بالاتر استعداد ابتلا به ديابت نوع 2 را دارند (Riaz, 2009). ديابت نوع 2 شايعترين نوع ديابت بوده و90? موارد بيماري ديابت را به خود اختصاص داده است. شيوع ديابت نوع 2 پيوسته در حال افزايش است و ميزان بروز ديابت نوع 2 در کودکان تقريبا ده برابر شده است.
3-2-1- علائم بروز ديابت
علايم بروز ديابت، به نوع ديابت و اينکه فرايند بيماري در چه مرحلهاي باشد بستگي دارد. مبتلابان به ديابت نوع 1 معمولا با علايم حاد کلاسيک هيپرگليسمي شامل: پرنوشي، پرادراري، کاهش وزن و به ميزان کمتر پرخوري، تاري ديد و خارش مراجعه ميکنند. در بيست و پنج درصد مبتلايان نشانه بروز بيماري براي اولين بار کتواسيدوز ديابتي است. در مبتلايان به ديابت نوع 2 اغلب چندين سال قبل از تشخيص بيماري وجود دارد. معمولا علائم نسبت به نوع 1 کمتر به صورت حاد بروز ميکند و ممکن است در افراد مسنتر همراه با لتارژي و خستگي ديده شود. افزايش مزمن قند خون ممکن است با اختلال رشد، حساس بودن به عفونتها و ترميم تاخيري زخم همراه ميباشد.
برخلاف بيماريهاي تک ژني، بروز بيماري توسط آلل موتانت در يک جايگاه ژني تحت تاثير قرار ميگيرد، در بيماريهايي شبيه به ديابت نوع 2 بروز بيماري به چندين جايگاه ژني که داراي اثر کوچک تا متوسط هستند، بستگي دارد. ديابت نوع 2، بيماري چند عاملي است که در آن ژنها نه تنها با يکديگر، بلکه با عوامل محيطي نيز در تعامل اند. اين احتمال وجود دارد که فعاليت و ترشح انسولين هر دو تحت کنترل واريانتهاي ژنتيکي در جايگاههاي ژني مختلف باشند. براساس مدل مولتي فاکتوريال، استعداد ابتلا به بيماري ميتواند به وسيلهي ترکيبي از واريانتهاي ژنتيکي متعدد و فاکتورهاي محيطي تعيين شود. استعداد ژنتيکي افراد لزوما باعث سندروم آشکار نميشود مگر اينکه آنها در معرض عوامل محيطي ويژهاي قرار گيرند.
4-2-1- درمان ديابت :
کميته متخصصين سازمان بهداشت جهاني در سال 1980 توصيه کرده است که روشهاي سنتي درمان ديابت، بيشتر مورد بررسي قرار گيرند، زيرا مرگ ناشي از ديابت در حال افزايش بوده و همچنين مشکلاتي در استفاده از داروهاي رايج فعلي وجود دارد (Suba et al., 2004). به طور سنتي در طول تاريخ از گياهان متفاوتي براي کاهش قندخون و بهبود اثرات ديابت، استفاده شده و در طب سنتي ايران و ساير کشورهاي جهان، اطلاعات کمابيش مفصلي در اين رابطه به چشم ميخورد. داروهاي گياهي به خاطر کم بودن اثرات جانبي، در دسترس بودن، هزينه نسبتا کم و مؤثر بودن آنها، به طور وسيع در سرتاسر جهان مورد تجويز واقع ميشوند (Venkates et al., 2003).
چندين نوع داروي کاهش دهنده گلوکز وجود دارد که از طريق مکانيزمهاي مختلف، اثرات ضدديابتي خود را اعمال ميکنند. از جمله اين مکانيسمها ميتوان به تحريک ترشح انسولين توسط داروهاي خانواده سولفونيل اوره و مگليتينيدها (Meglitinides)، افزايش جذب محيطي گلوکز توسط بايگوانيدها (Biguanides) و تيازوليدينديونها (Thiazolidinediones)، به تأخير انداختن جذب کربوهيدراتها از روده توسط مهارکنندههاي آلفا_ گلوکوزيداز، کاهش گلوکونئوژنز کبدي توسط بايگوانيدها و تيازوليدينديونها (Modi, 2007)، افزايش غلظت سرمي GLP-13 و کاهش خالي شدن معده توسط آنالوگهاي پپتيدي جديد مانند اگزناتيدها (Exenatide) و ليراگلوتيدها (Liraglutide) و مهارکنندههاي 4DPP-4 اشاره کرد (Hui et al., 2005). اين درمانها داراي معايبي نظير توسعهي مقاومت دارويي، اثرات جانبي و حتي سمي بودن تا کمبود پاسخدهي ميباشند. به عنوان مثال سولفونيل اورهها در مدت 6 سال کارايي خود را در 44 درصد بيماران از دست ميدهند. 3/2 از داروهاي تجويز شده براي کودکان مؤثر نيستند ( Michal et al., 2005 and Defronzo, 1999). به علاوه هيچ کدام از اين داروهاي کاهش دهندهي گلوکز به طور مؤثر افزايش ليپيدهاي خون را کنترل نميکنند (Derek, 2001). با شيوع در حال افزايش ديابت در جمعيت روستايي و به علت اثرات نامساعد داروهاي صناعي، يک نياز آشکار براي توسعهي منابع گياهي طبيعي براي داروهاي ضد ديابت وجود دارد (Venkatesh et al., 2003). همچنين اثرات جانبي داروها و تداخلات آنها با يکديگر که در بدن انسان يا در هنگام آزمايشهاي مختلف آشکار ميشود نيز مسأله مهمي است که بايد مدنظر باشد (Bathaie et al., 2001). مواد مؤثر موجود در گياهان دارويي مختلف، از طريق مکانيزمهاي متفاوتي قادر به کاهش قند خون هستند. عمدهي اين مکانيزمها عبارتند از: افزايش ترشح انسولين، فعال کردن مسير کاتابوليسم گلوکز، مهار يا غير فعال کردن مسير گلوکونئوژنز، هدايت گلوکز به داخل سلول، جذب گلوکز آزاد و ممانعت از اتصال آن به پروتئينها، افزايش ظرفيت آنتياکسيداني و ممانعت از آسيبزايي اکسيدانهاي توليد شده در مسيرهاي مختلف که ممکن است ناشي از ازدياد گلوکز و توليد محصولات نهايي گليکه يا ساير مسيرهاي متابوليک باشد و سرانجام ممانعت از جذب گلوکز از روده. (بطحايي و همکاران، 1391). يکي از مهمترين مسائل مورد توجه در علوم پزشکي و حتي تجارت جهاني به توليد، فرآوري و استفاده از گياهان دارويي ميباشد (Pirzad et al., 2006). به طوريکه بعد از اسلحه سازي دومين صنعت پول ساز بزرگ جهان توليد و تجارت داروئي ميباشد (Riazi,1997).در سال 2008 سرمايه در گردش بازار جهاني گياهان دارويي تا سال 2005 بالغ بر 5 تريليون دلار گردد (اميد بيگي، 1379). چين سالانه 8 ميليارد دلار از توليد گياهان دارويي درآمد کسب ميکند. در ايران با وجود حجم عظيم منابع گياهان دارويي، بخشي از نياز جامعه از کشورهايي مثل هند وارد ميشود (افشار، 1385). در حال حاضر سطح زيرکشت گياهان دارويي در ايران 91 هزار هکتار و ميزان توليد اين محصولات 100 هزار تن است. صادرات گياهان دارويي ايران در سال 1384 کمتر از 40 ميليون دلار بود (افشار، 1385). در حاليکه در سال 1387حجم مبادلات دارويي ايران به 89 ميليون دلار رسيد (زماني و همکاران، 1387). بشر همواره جهت رفع نارسائيها و بيماريهاي خود نياز به استفاده از داروهاي طبيعي داشته و دارد. اهميت توليد و فرآوري گياهان دارويي بدليل عوارض جانبي کمتر، عدم توانايي در توليد برخي داروها و همچنين هزينه بالاي توليد بسياري از مواد دارويي، روز به روز در حال افزايش است و بيشتر کشورها سرمايه گذاري زيادي را در راستاي توليد گياهان دارويي انجام دادهاند (letchamo, 2006). در حال حاضر يک سوم داروهاي مورد استفاده بشر را داروهاي با منشاء گياهي تشکيل ميدهند و اين ميزان به شدت رو به افزايش است (اميد بيگي، 1379).
3-1- گياه جغجغه ((Prosopis farcta
Prosopis farcta يا گياه جغجغه متعلق به خانواده حبوبات (leguminacea) است. اين گياه چوبي و چندساله است و بيشتر در مناطق گرم خشک يافت مي گردد. نام انگليسي آن Syrian mesquite يا کهور سوري است. در مناطقي که از علف کش ها استفاده نمي گردد(Qasem, 2007). طول اين گياه بيش از دو متر هم مي رسد و تيپ رشدي کاملاً شبيه به انگور را داراست.
سيستم ريشهايي و ريزومهاي اعجاب انگيز آن توانايي نفوذ تا عمق 20 متري زمين را دارد. گلهاي کوچک زردرنگ آن در تيرماه تا شهريور بسته به موقعيت جغرافيايي ظاهر ميگردند. هر گلآذين داراي يک يا دو غلاف است که در حالت رسيده رنگ قهوهايي تيره دارد(Fterich et al., 2011). در برخي از مناطق آسيار نقش علوفهايي نيز دارد ولي در اکثر مناطق به عنوان علف هرز محسوب ميگردد. اين گياه در طيف وسيعي از مناطق آسيا و آفريقا از هند تا ايران و عراق و سوريه و مصر و الجزاير يافت مي گردد. علت اين امر تطابق فوق العاد بذور اين گياه با شرايط سخت در دماهاي بالا يا پايين و رطوبت هاي بسيار کم است(; Fterich et al., 2011; Stambouli et al., 2012 Valverde et al., 2010 ).
اين گياه در کانالهاي آب و مزارع به وفور يافت ميگردد و به شوري آب کاملاً مقاوم است. علف هرز اصلي مزارع کنجد است. مبارزه براي حذف اين گياه از مزارع به دليل وجود ريزومهاي عميق آن دشوار است(Fterich et al., 2011).
1-3-1- خواص دارويي جغجغه
از جمله خواص دارويي اين گياه: معالجه زخم معده، سقط جنين، اسهال خوني، روماتيسم، التهاب حنجره، دردهاي قلبي و تنگي نفس ميباشد (Al-Qura, 2008). همچنين در تحقيقات ديگر به خواص ضد ديابتي (Saad, 2005; Jarald, 2008) و فوايد ضد اسپاسم، تسکين دهندگي و ضد التهابي گياه جغجغه اشاره شده است (Al-Qura, 2008; Frez, 2009). گياه جغجغه داراي خصوصيات آنتي اکسيداني، ضدالتهابي و آنتيآپوپتوزي است (Schultke, 2004). برخي ترکيبات موثر موجود در گياه Prosopis عبارتند از: 5-هيدروکسيل، ال-آرابينوز، لکتين، توکسين، تريپتامين، آپيگنين و آلکالوئيدها (Harzallah and BenJannet, 2005).گياه جغجغه داراي خصوصيات ضد اسپاسم است (AL-Quran, 2008). براي درمان ديابت نيز مورد استفاده قرار گرفته است ) Yaniv et al., 1999). بخشهاي آلکالوئيدي و سسکوئيترپنهاي موجود در اين گياه داراي فعاليت آنتيميکروبي است ( Jawad et al., 1998). گياه جغجغه در ايران جهت التيام زخم ميان عوام به خصوص در منطقه سيستان و بلوچستان کاربرد دارد.
در برخي از منابع اثرات ضد ديابتي بويژه التيام زخمهاي ناشي از ديابت براي اين گياه ذکر گرديده است. هرچند هنوز مکانيسمهاي تاثير آن بر ديابت در انسان به خوبي نشان داده نشده است(Yaniv et al., 1987).
در کشور اردن نيز از عصاره حاصل از ريشه اين گياه در درمان ديابت استفاده ميشود(Al-Aboudi and Afifi, 2011)
4-1- فسفوفروکتوکيناز 1(PFK-1):
نقش مهم و کليدي فسفوفروکتوکيناز 1 در تنظيم گليکوليز در بسيار از انواع سلولها در اناسن و حيوانات مختلف مورد بررسي قرار گرفته است. فعاليت اين آنزيم تحت تاثير بسيار ي از فاکتورها مانند ATP، ADP، AMP، فروکتاز 2،6 – بي فسفات(fru)، وسيترات قرار دارد. Fru عامل بسيار قوي محرک فسفوفروکتوکيناز 1 بوده و در همه پستانداران شناسايي گرديده است(Evans et al., 1981).
ژن فسفوفروکتوکيناز1 در کبد وجود دارد و آنزيمي را کد مي کند که باعث تبديلي D- فروکتاز 6- فسفات به دي فروکتاز 1،6 بايوفسفات ميگردد. اين آنزيم تترامري است که متشکل از چهار زير واحد متفاوت بوده و ممکن است توسط ژنهايي مرتبط با آن در بافت هاي مختلف کد گردد(Evans et al., 1981 Yi et al., 2012; ).
مکانيسم alternative splicing باعث ايجاد واريانتهاي بسيار متنوعي از اين ژن گرديده است. دو بيماري مهم با نقص در اين آنزيم ارتباط مستقيم دارد که شامل hemolytic anemia due to phosphorofructokinase و سندرم خودايمني polyendocrine است. اين آنزيم در حقيقت سومين مرحله از متابوليسم گليکوليز که ده مرحله است را کاتاليز مي کند(Hellinga and Evans, ;1987 Papagianni and Avramidis, 2012)
شکل1 محل قرار گيري اين ژن در انسان را بر روي کروموزوم 21 و منطقه q22.3 نشان مي دهد. اين ژن در موش 22/87 و 23/94 درصد تشابه توالي به ترتيب اسيد نوکلئيک و اسيد آمينه با فسفوفروکتوکيناز1 انساني دارد. نکته مهم در رابطه با فعاليت اين آنزيم محيط داخل کبد است که در شرايطي که Ph يا غلظت ADP در کبد بالا باشد فعاليت آن به شدت کاهش مي يابد.
شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکيناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان
آناليز توالي اسيد آمينه و اسيد نوکلئيک فسفوفروکتوکيناز 1 نشان مي دهد که اين ژن در پستانداران از دوبرابر شدن ژن مشابه آن در پروکاريوتها منشا گرفته است.
Fructose-6-phosphate + ATP fructose-1, 6-bisphosphate + ADP
نکته جالب براي اين آنزيم اين است که ATP داراي دو جايگاه اتصال بر روي فسفوفروکتوکيناز 1 است. اگر به جايگاه فعال آنزيم متصل گردد نقش سوبسترايي داشته و اگر به جايگاه تنظيمي آنزيم متصل گردد موجب مهار فعاليت آن و توقف گليکولايزيز مي شود. AMP اين خاصيت مهار کنندگي ATP بر روي فسفوفروکتوکيناز 1 را از بين مي برد. بنابراين بيان صحيحتر اين اس که نسبت بيشتر ATP/AMP باعث فعال شدن بيشتر فسفوفروکتوکيناز 1 ميگردد. بنابراين وقتي که شارژ انرژي سلول کم مي شود گليکولايزيز از طريق فسفوفروکتوکيناز 1 فعال مي گردد(Nakajima et al., 2002; Shirakihara and Evans, 1988 Vaz et al., 2012).
اهميت فعاليت فسفوفروکتوکيناز 1 نه تنها از اين جنبه است که واکنشي به شدت انرژي زا را کنترل مي کند بلکه اولين مرحله در واکنشهاي گليکولايزيز است که واکنش يکطرفه بوده و برگشت ناپذير است. اين باعث ميگردد که کنترل شديدي بر روي ميزان گلوکز و ديگر مونوساکاريدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آيد. تا قبل از اين مرحله اين امکان وجود دارد که گلوکوز 6 فسفات به پنتوز فسفات و يا به گلکوز 1 فسفات تبديل گردد(Evans et al., 1981).
شکل2-1- فروکتوز 2-6 بي فسفات مهمترين فعال کننده آنزيم فسفوفروکتوکيناز 1
هنگامي که ميزان اسيد لاکتيک در ماهيچه ها در اثر فعاليت زياد بالا مي رود PH درون عظله کاهش بافته و توليد انرژي از طريق مهار فسفوفروکتوکيناز 1 اتفاق مي افتد. اين امر باعث مي گردد که ماهيچه توان انجام فعاليت بيشتر را نداشته باشد و از تجمع بيش از حد اسيد در آن که موجب آسيب به ماهيچه مي گردد جلوگيري به عمل ميآيد.
فيدبک منفي نيز بر روي چرخه گليکولايزيز وجود دارد. به اين صورت که از محصولات پايين دست اين چرخه PHOSPHOENOLPYROVIC ACID يا PEP است که باعث مهار فسفوفروکتوکيناز 1 نيز مي گردد. از طرفي در چرخه کربس هنگاميکه آنزيمهاي اين چرخه به ماکزيمم فعاليت خود رسيدند سيترات توليد مي گردد که بازهم بر روي فسفوفروکتوکيناز 1 اثر مهاري شديدي دارد(Evans et al., 1981).
اما مهمترين فعال کننده اين آنزيم فروکتاز 2-6 بايوفسفات است که که از فروکتاز 6 فسفات توسط فسفوفروکتوکيناز 2 ساخته مي شود.
شکل3-1- مراحل گليکوليز
مرحله سوم که با مربع قرمز مشخص گرديده است واکنش برگشت ناپذيري است که توسط فسفوفروکتوکيناز 1 کاتاليز مي گردد.
گليکوژن از طريق فعال سازي پروتئين کيناز A باعث مهار فعاليت کينازي فسفوفروکتوکيناز 1 ميگردد. گاهاً موتاسيوني در اين ژن رخ مي دهد که باعث مي گردد فرد به بيماري Tarui مبتلا گردد که در اثر آن تحليل عضلات (myopathy)، حضور ميوگلوبين در ادرار(myoglobinuria) و همولايزيز رخ دهد. در سلول هاي سرطاني رشد سريع و توسعه خارج از برنامه آنها موجب hypoxia يا فقر اکسيژن مي گردد. اين عامل شروع کننده تغييراتي در سرين 529 فسفوفروکتوکيناز 1 مي گردد و فعاليت آن به شدت افزايش مي يابد و از اين طريق به توسعه و رشد تومور کمک مي شود(; Gomez et al., 2013 Vaz et al., 2012).
موجودات مدل براي مطالعه نقش هاي فسفوفروکتوکيناز 1 کبدي به کار گرفته مي شوند. لاين هاي موش هاي ناک اوت شرطي (conditional knock out mouse) يکي از قسمت هاي توليد موش هاي ناک اوت در کونسرسيوم بين المللي موش هاي ناک اوت است. اين پروژه بسيار بزرگ براي ايجاد موتاسيون براي مطالعه نقش هاي ژن هاي مورد هدف دانشمندان است. حيوانات نر و ماده در برنامه هاي غربال گري استاندارد بر اساس فنوتيپ ها براي بررسي اثرات حذف ژن ها مورد مطالعه قرار مي گيرند. در بين 26 تستي که بر روي اين موش هاي موتان صورت پذيرفته است سه مورد عدم نرمال بودن مشاهده گرديده است. براي ژن فسفوفروکتوکيناز 1 تنها موش هايي که بصورت هتروزيگوت ناک اوت بودند توانايي رسيدن به سن بلوغ را داشتند.
5-1- ضرورت و اهداف تحقيق:
شيوع بالاي ديابت و مشكلات فردي و اجتماعي حاصل از آن از يك سو و لزوم احياي طب سنتي و شناسايي اثرات آنتي ديابتيك گياهان دارويي موجود در طبيعت كه داراي آثار درماني با ارزشي هستند، از سوي ديگر ما را بر آن داشت تا اثر عصاره الکلي برگ گياه چغک را مورد مطالعه قرار دهيم.
از آنجا که ژنهاي بيان شده در مسير متابوليسم کربوهيدرات، اسيد آمينه، چربي، اسيد چرب، استروئيد و سيستم ايمني و دفاعي بدن متفاوت هستند، لذا در اين مطالعه، ژن فسفو فروکتو کيناز براي مطالعه اثر کاهندگي قند خون انتخاب شده است. چراکه درمان با عصاره الکلي گياه جغجغه ممکن است تغييرات قابل توجهي بر بيان بيان ژن فسفو فروکتو کيناز در موش ديابتي نشان دهد که بر اساس اطلاعات تا کنون تحقيق و پژوهشي در کشور در اين مورد صورت نگرفته است. تحقيق حاضر در جهت نيل به هدف ذيل انجام شده است.
– ارزيابي تاثير عصاره الکلي برگ گياه جغجغه بر بيان ژن فسفو فروکتو کيناز-1 در موش هاي ديابتي نوع 1
1-2- اثرات ضد ديابتي گياهان
استفاده از گياهان دارويي قدمتي همپاي بشر داشته و براي مدت طولاني يکي از مهمترين ابزارهاي انسان براي غلبه بر بيماري بوده است. پس از ظهور پزشکي نوين و استفاده گسترده از داروهاي شيميايي گرايش مردم برخي کشورها به گياهان دارويي کاهش يافت. اما اکنون پس از حدود يک قرن از حاکميت مطلق پزشکي نوين مجددا طب گياهي قد برافراشته و استقبال بشر به آن رو به افزايش است. عوارض جانبي فراوان داروهاي شيميايي و ناتواني پزشکي کلاسيک در درمان بيماري هاي مزمن نظير آسم، ديابت، روماتيسم و فشارخون از جمله دلايل گرايش مردم به اين گياهان محسوب مي شود. سازمان جهاني بهداشت نيز عليرغم تمرکز بر گسترش پزشکي نوين همواره از طب سنتي و استفاده علمي از گياهان دارويي حمايت نموده و در اين ارتباط کتب و مقالات متعددي را منتشر کرده است ghorbani and rakhshandeh, 2012)).
ديابت يك بيماري شايع در جهان است كه بر اساس گزارش سازمان جهاني بهداشت اكنون حدود 400 ميليون نفر در دنيا به آن مبتلا هستند. عوارض متعددي نظير آسيب هاي كليوي، اختلالات بينايي و نارسايي قلبي در نتيجه ي ديابت ايجاد مي شوند (Deshpandeh et al., 2008). در حال حاضر انسولين و دارهاي كاهنده ي قند خون خوراكي براي درمان ديابت استفاده مي شوند (Lorezanti et al., 2010)از اين داروها اگرچه اثرات نسبتا مفيدي در رابطه با كاهش قند خون دارند اما مي توانند به بيمار عوارضي نظير شوك هيپوگليسمي (كاهش شديد قند خون)، افزايش وزن، اختلالات كبدي و اسيدوز متابوليك را تحميل كنند
(Ghorbani and Rakhshandeh et al., 2012). بنابراين نياز به يافتن تركيبات موثرتر با عوارض جانبي كمتر اجتناب ناپذير بوده و استفاده از داروهاي جايگزين از جمله داروهاي گياهي مورد توجه قرار گرفته است.
1-1-2- انار
انار با نام علمي Punica granatum از گياهان خانواده Punicaceae است. برخي از تركيبات موجود در آب انار عبارتند از: آنتوسيانين ها (Anthocyanins)، گلوكز، ويتامين C، اسيد الاجيك (Ellagic acid)، اسيد گاليك، اسيد كافئيك، كاتچين (Catechin)، كرستين (Quercetin)، روتين (Rutin)، مواد معدني متعدد (به ويژه آهن) و اسيد هاي آمينه (Jarenka, 2008). بر اساس نتايج تحقيقاتي كه در زير ارائه شده آب انار و عصاره گل هاي آن براي كنترل ديابت مفيد است.
2-1-2-مكانيسم اثر انار در ديابت:
(فاروقي و اقتدار، 1378)، افزايش فعاليت آنزيم هاي آنتي اكسيدان بدن (Huang et al., 2005; Rosenblat et al., 2006). تحريك ورود گلوكز به سلول ها Huang et al., 2005) ) Ghorbani and rakhshandeh, 2012)). تحريك فعاليت peroxisome proliferators-activated receptor (PPAR?)5 در بافت هاHuang et al., 2005,Li et al.,2008, Xu et al., 2009)). PPAR? گروهي از فاكتور هاي رونويسي از ژن ها هستند كه در اعمالي نظير جذب اسيد هاي چرب و ذخيره آنها، سوخت و ساز گلوكز و فرآيند هاي التهابي نقش دارند. كاهش فعاليت آنزيم آلفا گلوكوزيداز و بنابراين مهار جذب گلوكز از روده (Li et al., 2008). Bagheri و همکاران در سال 2009 ، در مطالعاتي كه بر روي موش هاي صحرايي مبتلا به ديابت نوع 2 انجام شده عصاره الكلي گل انار با مقدار 500 ميلي گرم به ازاي كيلوگرم وزن بدن توانسته است ميزان قند خون غير ناشتا را كاهش دهد. عصاره فوق به صورت خوراكي روزي يك بار تجويز شده بود. در يك مطالعه طول درمان 2 هفته و در مطالعه ديگر مدت تجويز عصاره فوق 6 هفته بود. در هر دو حالت اثر كاهندگي قند خون تنها در حيوانات ديابتي غير ناشتا ايجاد گرديد و در موش هاي ديابتي ناشتا و يا موش هاي نرمال قند خون كاهش نيافت (Huang et al., 2005; Li et al., 2008). با مطالعه بيشتر مشخص گرديد كه عصاره فوق آنزيم آلفا گلوكوزيداز را مهار مي كند كه اين مي تواند مكانيسمي براي جلوگيري از افزايش بيش از حد قند خون متعاقب خوردن مواد قندي باشد(Li et al., 2008). همچنين عصاره فوق توانست در بافت قلب ميزان PPAR-? و پروتئين انتقال دهنده گلوكز به نام GLUT4 (Glucose transporter 4) را افزايش دهد كه معناي آن افزايش اثرات انسولين است (Huang, 2005). GLUT4 يك پروتئين سلولي است كه گلوكز را از خارج به داخل سلول وارد مي كند. عصاره آبي گل انار نيز اثرات ضد ديابتي ايجاد مي كند. در يك مطالعه، مقادير 250 و 500 ميلي گرم به ازاي كيلوگرم وزن بدن از اين عصاره براي 21 روز به موش هاي صحرايي ديابتي شده با استرپتوزوتوسين خورانده شد. اين درمان سبب كاهش قند، تري گليسريد، كلسترول تام، 6LDL و VLDL7 در خون حيوانات شد. از سوي ديگر ميزان شاخص هاي آنتي اكسيدان خون از جمله آنزيم هاي گلوتاتيون پراكسيداز (Glutathione peroxidase)، گلوتاتيون ردوكتاز و سوپر اكسيد دسموتاز افزايش يافت (Baghri et al., 2009). اثر پايين آورندگي قند خون گل انار در مطالعه Jafri و همكارانش در سال 2000 نيز مشاهده شده است. در اين مطالعه عصاره آبي – الكلي گل انار با مقادير 300، 400 و 500 ميلي گرم به ازاي كيلوگرم وزن بدن به موش هاي صحرايي ديابتي شده با آلوكسان و غير ديابتي خورانده شد. عصاره فوق به ويژه با مقدار 400 ميلي گرم به ازاي كيلوگرم وزن بدن توانست از افزايش شديد قند خون متعاقب خوردن گلوكز جلوگيري نمايد. اين اثر هم در موش هاي صحرايي نرمال و هم ديابتي مشاهده شد. محققان گزارش كرده اند كه عصاره گل انار مي تواند سبب بهبود اختلال كبد چرب در حيوانات ديابتي شود. بر اساس مطالعه ايي كه توسط Xu و همكارانش در سال2009 بر روي موش هاي صحرايي مبتلا به چاقي و ديابت صورت گرفته است، مقدار500 ميلي گرم به ازاي كيلوگرم وزن بدن (خوراكي به مدت 6 هفته) سبب كاهش محتوي تري گليسريد كبد مي شود. همزمان با اين اثر، افزايش بيان ژن PPAR-? در كبد ايجاد شد كه بيانگر بهبود فرآيندهاي درگير در سوخت و ساز اسيد هاي چرب است. در مطالعات انساني نيز اثرات آنتي اكسيداني آب انار مشاهده شده است. در مطالعه ايي كه توسط Rosenblat و همكارانش در سال 2006 انجام شده است به بيماران مبتلا به ديابت نوع 2 روزانه 50 ميلي ليتر آب انار به مدت 3 ماه داده شد. اين درمان موجب اثرات آنتي اكسيداني از جمله كاهش ليپيد پراكسيدازها (Lipid peroxidases) و افزايش گروه هاي تيول در سرم گرديد. با اين حال در اين بيماران قند، كلسترول و تري گليسريد خون تحت تاثير آب انار قرار نگرفت. در مطالعه اي كه توسط اسماعيل زاده و همكارانش در سال 2006 انجام گرديد به 22 بيمار ديابتي به مدت 8 هفته روزانه 40 گرم پودر ميوه انار داده شد. در پايان اين مدت كاهش قابل توجهي در ميزان كلسترول تام و LDL خون ايجاد شد. از جمله اثرات مفيد ديگر آب انار كاهش فشار خون در افراد ديابتي است. اين اثر در بيماران مبتلا به ديابت نوع 2 كه به مدت 6 هفته روزانه 200 ميلي ليتر آب انار مي خوردند گزارش شده است (Sohrab et al., 2008).


پاسخ دهید