3-8-8- بررسي کمي بيان ژن با استفاده از روش واکنش زنجيرهاي پليمرازپيوسته49
3-8-8-1-روش Ct مقايسهاي براي کمي سازي نسبي50
3-8-6- آناليز آماري52
فصل چهارم نتايج
4-1- بررسي وزن بدن و بافت بيضه پس از 14 روز تزريق54
4-2- بررسي ماکروسکوپي بافت بيضه55
4-3- بررسي ميزان ROS در بيضهي گروه کنترل و آزمون56
4-3-1- اندازه گيري ميزان O2 و H2O256
4-4- نتايج ارزيابي شکست DNA اسپرم با تست TUNEL59
4-5- بررسي وضعيت بياني ژن Kdm5d در بافت بيضه61
4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بيضه61
4-5-2- بررسي صحت سنتز cDNA62
4-5-3- بررسي بيان کمي ژن Kdm5d در بافت بيضه63
فصل پنجم بحث و نتيجهگيري
5-1- بحث و نتيجه گيري کلي67
5-2- پيشنهادات:70
منابع71
خلاصه انگليسي80
ضمائم81
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1: انواع آنتياکسيدانها و مکانيسم عملکرد آنها17
جدول 3-1: ترکيب محيط TCM38
جدول 3-2: ترکيب محيط 38
جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالي پرايمر مورد استفاده40
جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تيمار نمونههايRNA43
جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA45
جدول 3-6: برنامه دمايي سنتز cDNA45
جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR47
جدول 3-8: برنامه دمايي RT-PCR و تعداد سيکلهاي هر مرحله47
جدول 3-9: اجزاي لازم براي انجام واكنش Real-Time PCR51
جدول 3-10: برنامه دمايي Real-Time PCR51
جدول 4-1: ميانگين وزن بدن در طول تزريق و بافت بيضه پس از 14 روز تزريق54
جدول 4-2: ميزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونههاي بيضهاي با استفاده از تکنيک فلوسايتومتري58
جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون60
جدول 4-4: دادههاي گزارش شده براي آناليز کمي ژن Kdm5d64
جدول 4-5: آناليز نتايج Real-Time PCR با استفاده از نرم افزار REST64
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1: ارتباط بين ATMو P53 در پاسخهاي ترميم DNA يا آپوپتوز حاصل از آسيب ايجاد شده توسط استرس اکسيداتيو.9
شکل 1-2: ارتباط بين افزايش توليد ROS با ناباروري15
شکل 1-3: فشردگي کروماتين قبل از ورود به ميوز توسط کمپلکس Smcy-MSH521
شکل 3-1: شمايي از لام نئوبار32
شکل 3-2: DCFH-DA و مکانيسم عمل آن34
شکل 3-3: روشهاي ارزيابي شکست DNA و نحوه تشخيص آنها36
شکل3-4: اساس روش TUNEL37
شکل 4-1: نمونههاي بافت بيضه در موشهاي کنترل و آزمون56
شکل 4-2: ارزيابي آسيب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با استفاده از ميکروسکوپ فلورسنت(1000×)60
شکل 4-3: نمونه RNAهاي استخراج شده از بافت بيضه62
شکل 4-4: محصولات RT-PCR.63
شکل 4-5: منحني تفکيک ژن مربوطه65
فهرست نمودار
عنوان صفحه
نمودار 4-1: مقايسه وزن بدن و بافت بيضه ميان گروه کنترل و آزمون.55
نمودار 4-2: نمودار هيستوگرام از سلولهاي بيضهاي در يکي از نمونههاي گروه کنترل و آزمون57
نمودار 4-3: نتيجه حاصل از بررسي ميزان ROS (H2O2 و ?O2) در نمونههاي بيضه بين دو گروه کنترل و آزمون59
نمودار 4-4: نتيجه حاصل از بررسي ميزان شکست DNA در نمونههاي اسپرم بين دو گروه کنترل و آزمون61
نمودار 4-5: نمودار بيان نسبي ژنKdm5d.65
استفاده ازماده ترت بوتيل هيدروپراکسايد t-BHPيک مدل حيواني از استرس اکسيداتيو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگي بيان ژن Kdm5d(Smcy
چکيده
ناباروري عمدهترين مشکل توليدمثلي است که حدود 15درصد زوج هاي جوان در جهان را درگير ميکند. اين عارضه دلايل مختلفي دارد که فاکتورهاي مردانه مسؤول 40 درصد اين دلايل ميباشند. در بررسي دلايل ناباروري مردان، استرس اکسيداتيو و فاکتورهاي ژنتيکي نقش اساسي ايفا مي کنند. گونه هاي اکسيژن فعال (ROS) ميتوانند سبب افزايش استرس اکسيداتيوشوند. افزايش استرس اکسيداتيو ميتواند موجب اثرات مخربي بر روي عملکرد سيستم توليد مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغيير بيان ژنهاي دخيل در اسپرماتوژنز شود.
در اين تحقيق با استفاده ازماده ترت بوتيل هيدروپراکسايد t-BHPيک مدل حيواني از استرس اکسيداتيو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگي بيان ژن Kdm5d(Smcy) ايجاد گرديد. اين ژن در مرحله لپتوتن/زيگوتن ميوز به کمک فاکتور ترميمي MSH5سبب دمتيله شدن هيستون 3 ليزين 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتين نقش مهمي داشت.پس از تعيين دوز LD50براي t-BHP، به ميزان يک دهم آن به مدت 14 روز به موشهاي نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقي تزريق شد. سپس ميزان ROS در بيضه بوسيله فلوسايتومتري اندازهگيري و ميزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجيده و بيان ژن Kdm5d مورد ارزيابي قرار گرفت.
فلوسايتومتري افزايش استرس اکسيداتيو در موشهاي گروه تيماري نسبت به گروه کنترل را نشان داد. همچنين ميزان شکست DNAدر موشهاي گروه تيماري نسبت به گروه کنترل با آزمايش تانل به اثبات رسيد. بيان ژن Kdm5d در گروه آزمون از طريق Real time PCR نشان داده شد. کاهش بيان ژن Kdm5d را ميتوان به آسيبهاي وارد شده به DNA و ساير مکانيزمها از جمله تغييرات اپيژنتيکي که ميتوانند در بيان ژنها تاثيرگذار باشند، نسبت داد.
کلمات کليدي: ناباروري مردان، استرس اکسيداتيو، ژنKdm5d
مقدمه :
ناباروري عمدهترين مشکل مربوط به سلامت سيستم توليدمثل در جهان است که حدود 15درصد زوجهاي جوان را درگير ميکند. حدود 40% از ناباروريها مربوط به فاکتورهاي مردانه است. اين عارضه دلايل مختلفي از جمله واريکوسل، عفونت، ضايعات انسدادي، سيستيک فيبروزيس، تومورها و علتهاي جديد همانند استرس اکسيداتيو دارد. استرس اکسيداتيو(OS) 1در نتيجه عدم تعادل بين گونههاي اکسيژن فعال (ROS)2و آنتي اکسيدانها در بدن ميباشد که ميتواند از طريق اختلال در فرايند اسپرماتوژنز، عملکرد و ساختار اسپرم(بدشکلي اسپرم، واکنش آکروزومي، آسيب به DNAو عدم لقاح) منجر به ناباروري مردان شود. راديکالهاي آزاد و پراکسيدها ازمتابوليسم اکسيژن در تمام سلولهاي هوازي سبب افزايش اکسيدانها در بدن ميشوند و مي‌توانند با اكسايش تركيبات درون سلولي، به عملکرد و بقاء سلولها از جمله اسپرمها‌ آسيب برسانند. از عواملي که بهعنوان سد دفاعي سلول، در برابر استرس اکسيداتيو عمل ميکنند آنتياکسيدانها هستند که بهصورت آنزيمي و غير آنزيمي در سلولهاي اسپرم و مايع مني وجود دارند. هدف از اين مطالعه بررسي تاثير استرس اکسيداتيو بر بيان ژن Kdm5d است.
فصل اول
کليات
1- ناباروري
ناباروري3 يکي از مشکلات باليني ميباشد که به دليل شيوع و اهميت آن، محققان روي اين موضوع متمرکز شدهاند(Comhaire, 1987). ناباروري در يک زوج بطورکلي به عنوان عدم توانايي براي بارداري بعد از يک سال مقاربت بدون جلوگيري تعريف ميشود که حدود 15% از زوجين را در گير ميسازد که 40% اين ناباروريها مربوط به فاکتورهاي مردانه ميباشد(Gnoth et al., 2005; Sharlip et al., 2002). ناباروري در مردان بوسيله آناليز مايع مني4 قابل تشخيص است. طبيعي بودن اسپرموگرام5 – تست تشخيصي که غلظت، تحرک و ريختشناسي اسپرمها را اندازهگيري ميکند – عدم حضور ساير اختلالات را ثابت نميکند(Poongothai, Gopenath, & Manonayaki, 2009). شواهد نشان ميدهند که آسيبهاي وارده به اسپرم بواسطه گونههاي فعال اکسيژن (ROS) يکي از دلايل مهم ناباروري در 30-80 درصد موارد ناباروري مردان محسوب ميشوند(Agarwal, Prabakaran, & Allamaneni, 2006).
1-1- علل ناباروري در مردان
علل ناباروري در مردان را ميتوان به چند گروه تقسيم کرد:
* اختلال در تعداد و عملکرد اسپرم که اين گروه از مردان داراي اسپرمگرام غير طبيعي هستند.
* ضايعات انسدادي که بيشتر مجاري ديستال را تحت تاثير قرار ميدهد مانند آزواسپرمياي انسدادي که ناشي از عوامل ژنتيکي از جمله فيبروز سيستيک است که موجب عدم مادرزادي مجراي وازدفران شود.
* اختلال در اسپرماتوژنز در نتيجه ضايعه در بافت بيضه در اثر ضربه به بيضه، عفونت شديد مجاري تناسلي، اشعه ايکس و شيمي درماني است.
* اختلالات اندوکرين که مربوط به غدد درون ريز از جمله هايپوگناديسم ميباشد(Esteves, Miyaoka, & Agarwal, 2011; Wiser, Sandlow, & K?hler, 2012).
* از جمله عوامل ديگر با وجود آناليز طبيعي مايع مني، سابقه نرمال، معاينه فيزيکي و همينطور رد ناباروري با فاکتور زنانه ميتوان به حضور آنتي باديهاي ضد اسپرم، آسيب DNA اسپرم و سطح بالايي از گونههاي فعال اکسيژن اشاره کرد(Cummins, Jequier, & Kan, 1994).
1-2- راديکال‌هاي آزاد
1-2-1- تعريف و نحوه تشکيل راديکال‌‌هاي آزاد
راديكال‌هاي آزاد6، تركيبات شيميايي حدواسط با طول عمر كوتاه بوده که داراي يک الکترون جفت نشده ميباشند، تمام والانس‌هاي آنها اشباع نشده و در واقع مولکولي غيراشباع هستند که براي به دست آوردن الکترون به مولکولهاي پايدار در اطراف خود حمله کرده و الکترون خود را به دست ميآورند و بدين ترتيب سبب اکسايش مولکولهاي ديگر ميشوند و اين چرخه ادامه مييابد(Gutteridge & Halliwell, 1999).
1-2-2- نحوه عملکرد راديکال‌هاي آزاد
راديکالهاي آزاد از چندين طريق نقش خود را ايفا ميکنند:
* يک راديکال آزاد ميتواند به مولکول ديگر حمله کند و با اکسايش آن مولکول خود را احياء کند.
* يک راديکال آزاد ميتواند به يک مولکول ديگر اضافه شود و يک ترکيب راديکالي ايجاد کند. به عنوان مثال راديکال هيدروکسيل مي‌تواند به گوانين موجود در DNA اضافه و سبب ايجاد راديکالي به نام 8- هيدروکسي‌گوانين7 شود.
* يک راديکال آزاد ميتواند اتم هيدروژن را از پيوند هيدروکربني (C-H) برداشته و اسکلت کربني را با يک الکترون جفت نشده باقي بگذارد که در سيستم موجود زنده با يکسري واکنشهاي زنجيرهاي همراه است(Pryor, 1984).
1-2-3- گونههاي فعال اکسيژن و نيتروژن
اصطلاح گونههاي فعال اكسيژن به راديكال‌هاي آزاد اکسيژن يا انواع فعال شده اكسيژن اطلاق مي‌شود. اکسيژن براي حفظ عملکرد سلولهاي طبيعي هوازي مانند اسپرماتوزوآ لازم است. شکست محصولات گونههاي اکسيژن فعال(ROS) ميتواند به عملکرد و بقا سلول آسيب رساند(Eve de Lamirande & Gagnon, 1995).
گونههاي فعال اكسيژن شامل يک طبقه بندي گسترده از جمله : راديکالها (يون هيدروکسيل، سوپراکسيد،اکسيد نيتروژن، پراکسيل وغيره) و غيرراديکالها(ازن، اکسيژن تنها ، پراکسيدليپيد، پراکسيد هيدروژن) و مشتقات اکسيژن ميباشند(Sikka, 2001).
همچنين گونههاي فعال نيتروژن شامل: (نيتروژن اکسيد، نيتروکسيل ، يون پراکسيدنيتريل وغيره) راديکالهاي نيتروژن آزاد در نظر گرفته شده و زير کلاس گروه ROS قرار ميگيرند(Darley-Usmar, Wiseman, & Halliwell, 1995).
1-2-3-1- نقشهاي بيولوژيک ROS
از نقشهاي مهم ROS ميتوان به موارد زير اشاره کرد: به عنوان پيامبرهاي درون سلولي عمل کرده و در مسيرهاي تنظيمکنندهي سلول فعال است، همچنين تنظيم بيان ژني بهويژه ژن مربوط به پروتئينهاي آنتياکسيداني را بر عهده دارند(Finkel, 1998; Jones, Hancock, & Morice, 2000). مطالعات زمينهاي نشان ميدهد ROS در تنظيم بلوغ اسپرم و فسفريلاسيون پروتئينهاي انزالي در آغاز تحريک اسپرم نقش مهمي دارد(R. Aitken & Vernet, 1997). بنابراين، حضورROS براي عملکرد عادي سلولها ضروري به نظر ميرسد و با توجه به غلظتشان ميتوانند اثرات فيزيولوژيک يا پاتولوژيک بر اسپرم داشته باشند.
1-2-4- توليد و منبع راديکالهاي آزاد
عوامل متفاوتي با منشا داخلي و خارجي ميتوانند سبب توليد راديکال آزاد در بدن شوند که اين منابع شامل موارد زير ميباشد:

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

* التهاب و آلودگيهاي ميکروبي منجر به توليد راديکالهاي آزاد توسط نوتروفيلها و ماکروفاژها ميشوند.
* واکنشهاي اکسيداسيون احياء (انتقال الکترون) در ميتوکندري: از طريق آنزيمهاي کاتاليز شده و همينطور انتقال يونهاي فلزي کاتاليز کننده همانند يونهاي آهن و مس، سبب توليد راديکالهاي آزاد اکسيژن به عنوان محصول فرعي مي شوند.
* آلودگي هوا (مواد شيميايي موجود در هوا)، آتش سوزي جنگل، فعاليتهاي آتشفشاني و سوزاندن ترکيبات آلي طي آشپزي نيز توليد راديکالهاي آزاد را سبب ميشوند.
* تشعشع پر انرژي يا يونيزه شده مانند UV، ماکروويو، پرتوهاي X و گاما، مصرف الکل و داروهاي خاص، استعمال دخانيات، فاضلابهاي صنعتي، پنبه نسوز، علف کشها، سموم قارچي، مواد شيميايي مازاد و استرس، از جمله عوامل دخيل در توليد راديکالهاي آزاد به ويژه ROS ميباشند(Agarwal & Allamaneni, 2011).
* مايع مني شامل انواع مختلف سلولها ماننداسپرم بالغ و نابالغ، سلولهاي گرد از مراحل مختلف اسپرماتوژنز، لکوسيتهاوسلولهاي اپي تليال مي باشد. از بين اين سلولهاي مختلف لکوسيتهاواسپرماتوزوآي نابالغ به عنوان دو منبع اصلي توليد گونههاي فعال اکسيژن شناخته شدهاند(Garrido, Meseguer, Simon, Pellicer, & Remohi, 2004).
1-2-4-1- توليد ROS توسط اسپرماتوزوآي غير طبيعي
توليد ROS در اسپرم غير طبيعي به دليل حفظ سيتوپلاسم اضافي در روند اسپرميوژنز است که به دو روش ROS را توليد ميکنند:
1- سيستم NADPH اکسيداز که در سطح غشاي پلاسمايي اسپرم فعال است.
2- NADH اکسيدوردوکتاز که در سطح ميتوکندري وجود دارد(R. J. Aitken, Buckingham, & West, 1992).
1-2-4-2- توليد ROS توسط لکوسيتها
توانايي لکوسيتها در توليد ROS به ميزان فعاليت آنها در پاسخ به تحريکات از جمله التهاب و عفونت بستگي دارد(F. F. Pasqualotto, Sharma, Nelson, Thomas Jr, & Agarwal, 2000). لکوسيتها در برابر اين تحريکات فعال شده، توليد NADPH افزايش يافته و در پي اين فرآيند، سطح ROS افزايش مييابد(Blake, Allen, & Lunec, 1987).
1-2-5- استرس اکسيداتيو
استرس اکسيداتيو (OS) عبارتست از عدم تعادل بين ROS و آنتياکسيدانها در بدن که سبب پراكسيداسيون ماكرومولكول‌هاي داخل سلول شده و منجر به اثرات ثانويه بر عملكرد سلول ميشود. راديکالهاي آزاد مانند ROS عاملي براي ايجاد استرس اکسيداتيو ميباشند و ميتوانند سبب آسيبهاي اکسيداتيو شوند(Griveau & Lannou, 1997).
1-2-5-1- مکانيسم عملکرد استرس اکسيداتيو
پس از القاء ROS و استرس اکسيداتيو 3 اتفاق در سلول ميافتد:
القاء ROS ميتواند موجب بيش از 20 نوع آسيب در DNA شود. عدم ترميم صحيح DNA توسط سيستمهاي ترميم 8BER، 9NER ميتواند باعث جهش ژن مانند جهش نقطهاي و پلي مورفيسم شود که ميتواند موجب تغيير در عملکرد و بيان ژنها شود(Barroso, Morshedi, & Oehninger, 2000). شايعترين آسيبهاي DNA آن موجب تبديل ترکيب گوانين سيتوزين به آدنين تيمين ميشود(Kemal Duru, Morshedi, & Oehninger, 2000).
اگر شکست در دو رشتهي DNA اتفاق بيفتدژن (10ATM) که محصول آن يک پروتئين کينازسرين / ترئونين است فعال شده، در نتيجه منجر به توقف چرخه سلولي، تعمير DNA به وسيله سيستمهاي ترميم 11NHEJ و 12HR ميشود.

گاهي آسيب به حدي زياد است که سيستمهاي ترميم DNA قادر به ترميم آن نبوده و باعث القاء آپوپتوز و مرگ سلول آسيب ديده ميشود(Wells et al., 2009). (شکل 1-1).
استرس اکسيداتيو

شکل(1-1): ارتباط بين ATMو P53 در پاسخهاي ترميم DNA يا آپوپتوز حاصل از آسيب ايجاد شده توسط استرس اکسيداتيو.
از علل احتمالي آسيب به DNAي اسپرم ميتوان به آپوپتوز ناقص ، عفونت بيضه، اسپرماتوژنز معيوب و استرس اکسيداتيو اشاره نمود(Bhuller & Wells, 2006).
1-2-5- اثرات استرس اکسيداتيو
تمام اجزاي سلولي ازجمله چربيها، پروتئينها، اسيدهاي نوکلئيک و قندها از اهدف استرس اکسيداتيو هستند. ميزان آسيب ناشي از استرس اکسيداتيو به مقدارROS درگير شده و عوامل خارج سلولي مانند دما، فشار اکسيژن و ترکيبات محيط اطراف از جمله يونها، پروتئينها و جاذب ROS بستگي دارد(Cocuzza, Sikka, Athayde, & Agarwal, 2007).
1-2-5-1- استرس اکسيداتيو و آسيب به DNA
آسيب DNA اسپرم به دو صورت ميباشد:
آسيبهاي تک رشته DNA که اشعههاي يونيزان و اختلال در بازسازي DNA اسپرم اين نوع آسيبها را ايجاد ميکنند.
آسيبهاي دو رشتهاي DNA که فعاليت کاسپازها و آندونوکلئازها و اثر مستقيم13ROS بر رشته DNA علت اين نوع آسيبها در دو رشته DNA ميباشند و منجر به آپپتوز ناقص ميشوند(Sakkas & Alvarez, 2010).
اولين گزارش منتشر شده در مورد اثرات ROS بر روي اسپرم، نيم قرن پيش بوده است. توليد بيش از حد ROS سبب پراکسيداسيون ليپيدي، آسيب به DNA و کاهش ظرفيت توليدمثل14ميشود(Makker, Agarwal, & Sharma, 2009).
در مطالعات مشخص شده است که اسپرماتوزوآ بالغ انسان اغلب سطوح بالايي از قطعه قطعه شدن DNA را نشان ميدهد که اين آسيب DNA، يک عامل مهم در تعيين عملکرد اسپرم ميباشد و با طيف گستردهاي از عوارض جانبي باليني در ارتباط است. از جمله اين عوارض ميتوان به افزايش اختلالات در مرحلهي لقاح و پيش از لانه گزيني،کم شدن ميزان لانه گزيني، نقص در رشد و نمو جنين و بروز سقط جنين اشاره کرد(R. Aitken & De Iuliis, 2010).
بازهايDNA به آسيب اکسيداتيو حساس بوده که در نتيجه سبب قطعه قطعه شدن DNA و آسيب جزيي در DNAسلولها مانند اسپرم ميشوند که ميتواند منجر به عوارضي در فرزندان از جمله : بيماريهاي ژنتيکي غالب مانند آکندروپلازيا، شرايط عصبي پيچيده مانند اسکيزوفرني، صرع، بيماري دو قطبي، اوتيسم و با افزايش ناهنجاريهاي مادرزادي سبب افزايش نرخ مرگ و مير و سقط ميشود(Singh, Muller, & Berger, 2003).
هنگاميکه آسيب اکسيداتيو وسيع باشد، آپوپتوز يا مرگ برنامهريزي شده سلول15 و فراگمنته شدن ژنوم جنين رخ ميدهد و در مواقعي که آسيبهاي اکسيداتيو کمتر است، لقاح اتفاق ميافتد اما اووسيت بايد شکستهاي DNA را ترميم کند(Kodama, Yamaguchi, Fukuda, Kasai, & Tanaka, 1997).
آپوپتوز يا مرگ برنامهريزي شده سلول، يک پاسخ غيرالتهابي به آسيبهاي بافتي است که توسط يکسري تغييرات بيوشيميايي و ريختشناختي16 مشخص ميگردد. اين فرآيند ظرفيت سلولهاي سرتولي را از طريق کنترل توليد بالاي گامتهاي نر و حذف اسپرماتوزوآهاي غيرطبيعي حفظ مينمايد. ROS با فعالسازي کاسپازها يک واکنش زنجيرهاي را آغاز ميکنند و سرانجام منجر به آپوپتوز ميگردند(Agarwal, Makker, & Sharma, 2008).
همچنين ROS ميتواند به DNAي ميتوکندريايي نسبت به DNAي هستهاي آسيب بيشتري برساند. بعد از القاي ROS، آسيبهاي وارده به DNA افزايش يافته و از طريق فعال شدن سيتوکروم C و در نهايت فعال شدن کاسپاز3 در تمام سلولهاي زايا از جمله اسپرماتوسيت اوليه، اسپرماتوسيت ثانويه، اسپرماتوگونيا و اسپرماتوزوآ، آپوپتوز مشاهده ميشود. در نتيجه تعداد اسپرم کاهش يافته و حالت اوليگواسپرمي ايجاد ميشود. گمان ميرود که چنين آسيبهايي ميتوانند عامل بيماريهايي چون ناباروري در انسان باشند. مجاورت نزديکDNAي ميتوکندري به زنجيره انتقال الکترون، مکانيسمهاي ناکارآمد ترميم DNA و فقدان هيستونها که مسبب فشردگي ساختار کروماتين هستند، به عنوان دلايل حساسيت DNAي ميتوکندري پيشنهاد ميشوند(George, Jiao, Bishop, & Lu, 2012).
1-2-6-1-2- اهميت سلامت DNA اسپرم
تراکم کروماتين اسپرم نقش مهمي در حفاظت از ژنوم پدر، در فرآيند لقاح و باروري تخمک دارد. در نتيجه بررسي سلامت DNAاز اهميت خاصي برخوردار است.
همچنين در تحقيقات گذشته نشان داده شده است که:
* بين پارامترهاي اسپرم وآسيبهايDNA رابطه معکوس وجود دارد(R. Mahfouz et al., 2010).
* در افراد نابارور ميزان شکستDNA بيشتر است(Turner & Lysiak, 2008).
* بين ميزان لقاح و آسيبDNA رابطه معکوس وجود دارد(Agarwal & Allamaneni, 2005).
* در همسران بيماراني که داراي ميزان قابل توجهي شکستDNA اسپرم هستند ميزان سقط افزايش مييابد(Jiang, He, Wang, & Zhu, 2011).
از اين رو بررسي و ارائه راهکارهايي در زمينه آسيب DNAي اسپرم ميتواند براي درمان زوجهاي نابارور حياتي باشد.
1-2-6-2- استرس اکسيداتيو در اسپرم
اسپرماتوزوآ نيز همانند ديگر سلولهايي که در شرايط هوازي زندگي ميکنند، با تضادي در مورد اکسيژن مواجه است. يعني از يک سو براي بقاء خود به اکسيژن نيازمندند و از سوي ديگر متابوليتهاي اکسيژن نظير ROSها ميتوانند براي بقاء سلول مضر باشند. در نتيجه ROS توليد شده در سلول بايد مدام غيرفعال شود به طوري که غلظت آن هميشه در حد بسيار اندک براي عملکرد طبيعي سلول باشد و اگر تعادلي بين توليد و حذف ROS نباشد، منجر به ايجاد شرايط استرس اکسيداتيو ميشود(Saleh & HCLD, 2002; Turner & Lysiak, 2008).
در واقع به علت اين که ميزان سيتوپلاسم اسپرم بالغ کم است و غلظت آنزيمهاي از بين برندهي ROS در اسپرم اندک ميباشد، اسپرم بيش از ديگر سلولها مستعد ايجاد استرس اکسيداتيو است. در ضمن، به علت اين که غشاء اسپرم حاوي مقادير بالايي از اسيدهاي چرب غيراشباع ميباشد، آسيبپذيري آن در برابر استرس اکسيداتيو زياد است. همچنين به دليل شکل خاص اسپرم، آنزيمهاي آنتياکسيدان داخل سلولي نميتوانند غشاء پلاسمايي احاطه کنندهي آکروزوم و دم را حفاظت نمايند(Fanaei, Azizi, & Khayat, 2013).
1-2-6-3- استرس اکسيداتيو و بيماريهاي ديگر
استرس اکسيداتيو در ديگر بيماريهاي انسان از جمله: آترواسکلروز، سرطان، ديابت، آسيب کبدي، روماتوئيد آرتريت، آب مرواريد،ايدز، بيماريهاي التهابي روده، پارکينسون، بيماري نورون حرکتي و شرايط مرتبط با تولد زودرس دخيل است( Pasqualotto, F et al., 2000).
1-2-7- اثراتROS
1-2-7-1- پراکسيداسيون ليپيدي غشاي پلاسمايي اسپرم
اسيدهاي چرب که حاوي بيش ازدوکربن با پيوند دو گانه هستند اسيدهاي چرب غير اشباع (PUFA17) ناميده ميشوند. ليپيدهاي موجود درغشاي پلاسمايي اسپرم که به شکل اسيدهاي چرب غير اشباع هستند از حساسترين مولکولها ميباشند. حملات ROSبه PUFA در غشاي سلولي منجر به شروع آبشاري ازواکنشهاي شيميايي بنام پراکسيداسيون ليپيدي ميشود که اين پراکسيداسيون ليپيدي براي تحرک اسپرم، ظرفيتيابي اسپرم و نفوذ به اووسيت ضروري ميباشد(J. Aitken, Buckingham, & Krausz, 1994; R. J. Aitken, Clarkson, & Fishel, 1989).
1-2-7-2- اثر روي تحرک اسپرم
پراکسيداسيون ليپيدي يک علت عمده براي از دست دادن تحرک دراسپرم است، در نتيجه افزايش سطح ROS با کاهش تحرک اسپرم ارتباط دارد. با اين حال، مکانيسم دقيقي براي اين رويداد مشخص نيست.
يک فرضيه حاکي از آن است که H2O2 از سراسر غشاء به داخل سلولها منتشر شده و مانع از فعاليت برخي آنزيمهاي حياتي مانند گلوکز 6- فسفاتدهيدروژناز (G6PD) ميشود و از طريق شنت هگزوز منوفسفات، دسترسي درون سلولي نيکوتين آميد آدنين دينوکلئوتيد فسفات (NADPH) را کنترل ميکند. NADPH به عنوان يک منبع الکترون توسط اسپرم براي توليد ROSاستفاده ميشود. مهار G6PD منجر به کاهش NADPH و تجمع گلوتاتيون اکسيده ميشود که ميتواند دفاع آنتياکسيداني اسپرماتوزوآ را کاهش و پراکسيداسيون فسفوليپيدهاي غشاء را افزايش دهد(Gomez, Irvine, & Aitken, 1998; Suleiman, Ali, Zaki, EL?MALIK, & Nasr, 1996)
1-2-8- ROS و استرس اکسيداتيو مايع مني
هنگاميکه تعادل بين ROS توليدي و آنتي اکسيدانها از بين ميرود، آسيبهاي اکسيداتيو قابل توجهي براي اکثر ارگانلهاي سلولي به دليل آسيب ديدن کربوهيدراتها، پروتئينها، ليپيدها و DNA رخ داده و در نهايت منجر به مرگ سلول ميشود. غشاي پلاسمايي اسپرم غني از اسيدهاي چرب غيراشباع است و به راحتي توسط ROS، تحت پراکسيداسيون ليپيدي قرار ميگيرد. لوکوسيتها و اسپرماتوزوآي نابالغ موجود در مني، H2O2 را از طريق سيستم NADPH اکسيداز توليد ميکنند. پراکسيداسيونH2O2 سميترين شکل ROS براي اسپرماتوزوآ ميباشد و به علت نفوذ به غشا بهراحتي ارگانلهاي سلولي را تحت تاثير قرار ميدهد. اين در حالي است که غشا نسبت به راديکال هيدروکسيل نفوذناپذير بوده و اثر نمودن آنها زمانبر است. در بافتي مانند بيضه با متابوليسم بالا، استرس اکسيداتيو ميتواند آسيبرسان باشد، بنابراين ظرفيت آنتياکسيدانهاي بافت بسيار مهم است.
امروزه مطالعات زيادي مبني بر اينکه استرس اکسيداتيو در حضور آنتياکسيدانها بر عملکرد اسپرم طبيعي تاثير نداشته و در نتيجه باروري اتفاق افتاده است، وجود دارد( Pasqualotto, F et al., 2000) .
1-2-9- ROS و ناباروري
بطور معمول در مرداني که علت ناباروري آنها ناشناخته است، برهم خوردن توازن بين ROS و آنتياکسيدانها، از دلايل محتمل ناباروري است(Agarwal et al., 2006). طي مطالعات اخير، در نمونههاي مني 25 تا 40 درصد مردان نابارور مقادير بالايي از ROS گزارش شده است. همچنين در نمونههاي مني مردان بارور، ظرفيت کلي آنتي‌اکسيداني18 (TAC) بالاتر از مردان نابارور است(Lewis, Boyle, McKinney, Young, & Thompson, 1995). از طرف ديگر، نيمي از مردان اوليگواسپرمي، سطح بالايي از ROS را در مايع مني نشان ميدهند(R. J. Aitken et al., 1989). حمله ROS به اسپرم، سبب کاهش بقا و افزايش نقص در شکل ظاهري اسپرم ميشود(E De Lamirande & Gagnon, 1992)،که اين آسيب وارده به عوامل متفاوتي نظير مقدار و مدت زمان تماس سلول با عامل اکساينده، اکسيژن، دما، غلظت يون‌ها، پروتئين‌ها و مهارکننده‌هاي ROS بستگي دارد. در مطالعاتي مشخص شده است که غلظت پائين پراکسيد هيدروژن، روي تحرک اسپرم اثري ندارد، اما از نفوذ اسپرم به اووسيت ‌جلوگيري مي‌کند(R. Aitken, Harkiss, & Buckingham, 1993).
شکل(1-2): ارتباط بين افزايش توليد ROS با ناباروري(Singh et al., 2003).
1-2-10- آنتي اکسيدانها
از عوامل از بين برندهي راديکالهاي آزاد ميتوان به آنتي اکسيدانهااشاره کرد که بهعنوان سد دفاعي سلول، در برابر استرس اکسيداتيو عمل ميکنند. آنتياکسيدانها به پنج گروه تقسيم ميشوند:
1) ترانسفرين19، هموپکسين20 از پروتئينهايي هستند که سبب کاهش دسترسي سلول به پيش اکسيدانهايي مانند آهن و مس ميشوند.
2) آنزيمهاي کاتالاز، پراکسيداز، سوپراکسيد ديسموتاز21(SOD) از جمله عواملي هستند که سبب از بين بردن راديکالهاي آزاد و ديگر انواع ROS ميشوند.
3) پروتئينهايي که سبب حفظ مولکولهاي زيستي در برابر استرس اکسيداتيو ميشوند، مانند: پروتئينهاي شوک حرارتي22.
4) ?-توکوفرول23، گلوتاتيون از مولکولهايي هستند که داراي وزن مولکولي پائين بوده و ميتوانند ROS را به دام اندازند.
5) ويتامينهاي E و C ازجمله عواملي هستند که به صورت غيرآنزيمي در بيضه به عنوان آنتياکسيدان عمل ميکنند(Agarwal & Sekhon, 2010).
1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتياکسيدانها به دو روش طبقه بندي ميشود:
* شکستن زنجيره: زماني که يک راديکال آزاد الکتروني را جذب کرده يااز دست ميدهد، راديکال دوم تشکيل ميشود. سپس اين مولکول همين کار را با مولکول سوم انجام ميدهد. اين روند تا زماني ادامه مييابد که طي آن راديکال بوسيله يک آنتياکسيدان شکننده زنجيره مانند بتا کاروتن و ويتامينها تثبيت شود، يا بهراحتي به يک محصول بي ضرر تبديل شود.
* راه بازدارنده: آنزيمهاي آنتياکسيدان مانند سوپراکسيد دسموتاز ، کاتالاز و گلوتاتيون پراکسيداز با کاهش ميزان تشکيل زنجيره از اکسيداسيون جلوگيري ميکنند. چنين آنتياکسيدانهايي با يافتن راديکالهاي آغازگر ميتوانند يک زنجيره اکسيداسيون را براي هميشه متوقف سازند. همچنين ميتوانند با تثبيت راديکالهاي فلزي مانند مس و آهن از اکسيداسيون جلوگيري کنند(Agarwal, Nallella, Allamaneni, & Said, 2004).
عمدهترين آنزيمهاي آنتياکسيداني که در بافت بيضه پستانداران بيان ميشوند عبارتند از: سوپراکسيد ديسموتاز، کاتالاز و گلوتاتيون پراکسيداز(Zini & Schlegel, 1997). همچنين برخي عوامل غيرآنزيمي که به عنوان آنتياکسيداني در بيضه عمل ميکنند ميتوان به ويتامين C، ويتامين E و ملاتونين اشاره کرد که در کاهش استرس اکسيداتيو بيضه موثر ميباشند(Choudhary, Chawala, Soni, Kumar, & Vyas, 2010; Lewin & Lavon, 1997; Park, Park, Lee, & Shin, 2003; Uguralp, Usta, & Mizrak, 2005; Zini & Schlegel, 1997).
در جدول (1-1) مکانيسم عملکرد برخي از آنتي اکسيدانهاي مهم ذکر شده است.
جدول(1-1): انواع آنتياکسيدانها و مکانيسم عملکرد آنها(Choudhary et al., 2010)
مکانيسم عملکردآنتياکسيداناين ويتامين اصليترين آنتياکسيدان شکننده زنجيره در غشاء پلاسمايي است و به طور مستقيم آنيون سوپراکسيد، پراکسيدهيدروژن و راديکال هيدروکسيل را خنثي ميکند، همچنين پراکسيداسيون ليپيدي را سرکوب کرده و احتمال ادغام شدن اسپرم و تخمک را افزايش ميدهد.ويتامين Eاين ويتامين نيز همانند ويتامين E نقش شکننده زنجيره را در غشاء پلاسمايي دارد و از ليپوپروتئين در مقابل راديکالهاي پراکسيل محافظت ميکند.ويتامين Cآنيونهاي سوپراکسيد راخنثي کرده و ميزان واکنش آکروزومي را بهبود ميبخشد همچنين سبب افزايش تحرک اسپرم ميشود.سوپراکسيد ديسموتازپراکسيدهيدروژن راخنثي کرده و ميتواند فقدان تحرکي که توسط لوکوسيتهاي توليد کنندهي ROS به وجود آمده را کاهش دهد.کاتالازمولکولي است که سبب احياي H2O2 و ساير پراکسيدها ميشود.گلوتاتيونآنتياکسيدان غيرآنزيمي است که يک عامل بالابردن انرژي است و مانع از آسيب پراکسيداتيو ميشود.کوآنزيمQ10
1-2-11- اثرات آنتياکسيدانها
1-2-11-1- تاثير بر تحرک اسپرم
آنتياکسيدانهايي مانند ويتامين E و C، گلوتاتيون، کاتالاز، سوپراکسيدديسموتاز و آلبومين مانع کاهش تحرک اسپرم و کوآنزيم Q سبب افزايش تحرک اسپرم ميشود. طي مطالعهاي ثابت شده است که نمونه اسپرم انکوبه مرد نابارور با 50ميکروگرم از کوآنزيم Q، سبب بهبودي در تحرک اسپرم ميشود(Lewin & Lavon, 1997).
1-2-11-2- تاثير بر روي کاهش آسيبهاي بعد از انجماد اسپرم
روش انجماد اسپرم و ذوب شدن آن سبب کاهش قابل توجه و غير قابل برگشت تحرک و فعاليت متابوليک اسپرم همراه با اختلال در غشاي پلاسمايي ميشود. بر اساس مطالعه در خصوص درمان با ويتامين E (10 ميلي مول/ليتر) که در کاهش آسيب ناشي از انجماد اسپرم موثر است. مشاهده شد که مکمل آزمايشگاهي (300 ميلي مول/ليتر) Rebamipide در نمونه مايع مني در طول انکوباسيون (C?37) و انجماد (C? 196 -به مدت سه روز)، منجر به کاهش معنيدار سطحROS ميشود(Park et al., 2003).
1-2-11-3- تاثير آنتياکسيدانها در جلوگيري از آسيب بهDNA
آنتي اکسيدانها به کاهش قطعه قطعه شدن DNA ناشي از ROSکمک ميکنند. بر اساس مطالعات درماني، مصرف مکمل هاي خوراکي روزانه به ميزان 1 گرم ويتامين C و E به مدت 2 ماه کاهش تعداد قطعه قطعه شدن DNA را از 1/22? به 1/9? را به همراه دارد. علاوه بر اين، پس از درمان با آنتياکسيدان، بارداري شيميايي (2/48? در برابر 9/6?) و حاملگي باليني (2/48? در برابر 9/6?) و لانه گزيني (6/19? در برابر 2/2?) بهبودي قابل توجهي را در مقايسه با نتايج پيش از 24 ICSI ارائه دادند.آلبومين نيز با خنثي نمودن پراکسيداسيون ليپيدها مانع از آسيب به غشاي پلاسمايي اسپرم و DNA ميشود(Twigg et al., 1998).
1-2-12- نقش آنتياکسيدانها (ربايندههاي25بالقوهROS) دراسپرم
ازآنجائيکه ROS داراي نقشهاي فيزيولوژيک متفاوتي ميباشد، حضورآنتياکسيدانها حالت پايداري از ROS را در پلاسماي مني ايجاد مينمايند. آنتياکسيدانهابه صورت فعال، راديکالهاي آزاد را جهت حفظ اسپرماتوزوآ در مقابل ROS از بين ميبرند. اين آنتياکسيدانها درهنگام خروج سيتوپلاسم طي اسپرميوژنز26، فقدان آنزيمهاي سيتوپلاسمي اسپرم راجبران مينمايند. در ميان آنتياکسيدانهاي بيولوژيکي شناخته شده، سوپراکسيدديسموتاز و کاتالاز نقش مهمي دارند. سوپراکسيدديسموتاز سبب تبديل مبدل آنيون.O2- به O2 و H2O2ميشود. کاتالاز H2O2 را به O2وH2O تبديل ميکند(Choudhary et al., 2010).
آنزيم SOD ، از طريق حذف راديکالهاي سوپراکسيد، از بيش فعال سازي پيش از بلوغ اسپرم27وظرفيتگيري28آ (مرحله ما قبل آخر در بلوغ اسپرماتوزوآ که جهت لقاح با تخمک ضروري است) قبل ازانزال جلوگيري مينمايد و در نهايت از پراکسيداسيون ليپيدي غشاي پلاسمايي جلوگيري بعمل ميآورد( Aitken, R et al., 1997).
آنزيم کاتالاز، -NO که القا کننده ظرفيتگيري اسپرم است- را نيز فعال مينمايد که يک مکانيسم پيچيده درگيرکننده H2O2 ميباشد( Aitken, R et al., 1997).
سيستم گلوتاتيونپراکسيداز/ردوکتاز،سيستم دفاعآنتياکسيداني است که غشاي پلاسمايي اسپرماتوزوآ را در مقابلH2O2 ، که مسئول شروع پراکسيداسيون ليپيدي است، محافظت ميکند. مکانيسم اين سيستم به اين صورت است که گلوتاتيون پراکسيداز (Se-GSH-Px) بااستفاده ازگلوتاتيون (GSH) به عنوان دهنده الکترون، راديکالهاي پراکسيل (ROO) را از منابعي چون H2O2 حذف مينمايد. سپس گلوتاتيون ردوکتاز (GSH-Red)، GSSG اکسيد شده را بهGSH احيا مينمايد(Gavella, M, et al 1992; Meybodi, A, et al, 2012).
پيرو نتايج بدست آمده،درمان بيماران آستنواسپرميا با آنتياکسيدانها سبب بهبود کيفيت اسپرم در روشهاي کمک باروري از جملهIVF ميشود(Mozdarani & Meybodi, 2004).
ويتامين E آنتياکسيدان اصليدرغشاي اسپرم ميباشد و ظاهرا اثر وابسته به دوز دارد. نحوهي عملکرد اين ويتامين به صورت شکنندهي زنجيره اکسيداسيون است و در حقيقت رباينده راديکالهاي آزاد، سوپراکسيد، پراکسيدهيدروژن و هيدروکسيل ميباشد.
ويتامين C نيز يکي ازآنتياکسيدانهاي موجود در مايع مني است که راديکالهاي آزاد را خنثي ميکند، همچنين از آسيبهاي ايجاد شده در DNA توسط H2O2 جلوگيري ميکند.
آنتياکسيدانهايي چون ويتامين E و C، گلوتاتيون،N -استيل سيستئين،SOD ،کاتالاز، آلبومين، تائورين و هيپوتائورين مانع مرگ و مير اسپرم ميشوند(Choudhary et al., 2010).
1-3- ژنتيک و ناباروري مردان


پاسخ دهید