3-5-1. د تو کسيفيه کردن LPS با روش قليايي…………………………..63
3-5-2. آزمون Novotny…………………………………………………..63
3-6. استخراج و خالص سازي Omp بروسلا آبورتوس RB51……………64
3-6-2. اندازه‌گيري پروتئين با روش لوري…………………………………..65
3-7. کونژوگاسيون Omp و LPS بروسلا آبورتوس………………………..68
3-8. ستون کروماتوگرافي براي تخليص کونژوگه………………………..69
3-8-1. مراحل پک کردن ستون کروماتوگرافي……………………….69
3-9. آزمون کنترل کيفي کونژوگه………………………………………71
3-9-1. کنترل تب زايي در خرگوش(in vivo test)……………………71
3-9-2. کنترل توکسيسيته غير عادي(Abnormal Toxicity)………..72
3-10. واکسيناسيون و سنجش ايمني زايي کونژوگه……………………..72
3-11. آزمون بررسي فعاليت باکتري کشي سرم حيوان(سرم باکتريسيدال اسيSBA)…………………………………………………………………73
3-11-1. اصول آزمون SBA……………………………………………74
4-1. تعيين ميزان LPS خام در نمونه استخراج شده با آزمون نووتني……77
4-2. تعيين غلظت پروتئين در نمونه Omp بروسلا آبورتوس RB51 به روش لوري…………………………………………………………………….80
4-3. نتايج کنترل کيفي کونژوگه……………………………………….81
4-6. نتايج بررسي کنترل توکسيسيته غير عادي(Abnormal toxicity)..82
4-5. نتايج کنترل تب زايي در خرگوش (in vivo test)………………..82
4-7. ارزيابي فعاليت باکتري کشي سرم باکتريوسيدال اسي(SBA)…………..83
فهرست شکل ها
شکل(2-1)- عفونت دريچه قلب توسط B.abortus ……………….12
شکل(2-2)بروسلا آبورتوس داراي منشاء گاوي…………………………………………..21
شکل(2-3) بروسلا سوئيس داراي منشاء خوک……………………………………………..22
شکل(2-4) بروسلا سوئيس داراي منشاء موش صحرايي………………………………….23
شکل(2-5) بروسلا سوئيس داراي منشاء پستانداران دريايي……………………………….24
شکل(3-1) کنترل سوش RB51 با استفاده از اکروفلاوين………………………………..60
شکل (3-2)کشت و درو بروسلا…………………………………………………………….61
شکل(3-3):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده……………………………..62
شکل(3-4) کيسه دياليز کونژوگه Omp+ LPS…………………………………………69
شکل(3-5): عبور کونژوگه از ستون کروماتوگرافي………………………………..71
فهرست نمودارها و جدول ها
جدول(4-1). تغييرات جذب نوري برحسب غلظت LPS استاندارد……………………78
نمودار(4-1): نمودار استاندارد غلظت LPS………………………………………………79
جدول(4-2). تغييرات جذب نوري برحسب غلظت Omp به روش لوري………………80
نمودار(4-2). نمودار استاندارد لوري……………………………………………………81
نمودار(4-3).کروماتو گرافي کونژوگه و فراکشن هاي آن……………………………..82
جدول(4-3): نتايج گشت رقت هاي مختلف سرم خرگوش تزريق شده با واکسن کونژوگه و واکسن زنده……………………………………………………………………………..85
چکيده
بروسلوز مهمترين بيماري عفوني مشترك بين انسان و دام است که در اثر آلودگي با بروسلا به وجود مي آيد. به خاطر ماندگاري بروسلوز،در دنيا ساليانه500000 نفر به اين بيماري مبتلا مي شوند.واکسن هاي مورد استفاده در بروسلوز همچون S19 و RB51 که به صورت زنده هستند، در مواردي منجر به بيماري در دام و يا انسان مي شوند. مصونيت عليه بروسلوز نيازمند القاي هردو پاسخ ايمني، به خصوص ايمني سلولي است بسياري از آنتي ژنهاي پيکره بروسلا به تنهايي خصوصيات کافي براي القاي اين پاسخ ها را ندارند. بدين لحاظ به نظر مي رسد واکسن زيرواحد مؤثر عليه بروسلوز احتمالا ترکيبي از چند جزء آنتي ژني خواهد بود.سويهRB51يک سويه واکسني پايدار، خشن غني از پروتئين غشاي خارجي مي باشد و مهمترين مزيت واکسيناسيون با اين سويه، عدم القاي آنتي بادي بر عليه زنجيرهO،LPSمي باشد يعني ايمني ايجاد شده بر عليه آن فقط از نوع سلولار مي باشد.آنتي ژنهاي غشاي خارجي از خارجي ترين اجزاي پيکره بروسلا هستند که درتماس مستقيم با سيستم ايمني ميزبان قرار دارند. بدين لحاظ به عقيده بسياري از محققين اين آنتي ژنها از اجزاي اصلي واکسن هاي زير واحد احتمالي خواهند بود.تزريقLPS نيز به تنهايي باعث القاي توليد آنتي باديهاي مصونيت زا مي گردد ولي سيستم ايمني سلولي را تحريک نمي کند. اين موضوع به دليل نقشLPSبه عنوان يک آنتي ژن غير وابسته به تيموس است. بدين لحاظ مصونيت ناشي ازLPSدر مقابل بروسلا، کوتاه مدت و ناقص است.بنابراين در اين پروژه هدف آن است که با چسباندنLPSبهOMPواکسن کاملي تهيه گردد که بتواند هم ايمني هومورال وهم سلولار را تحريک نمايد.به اين منظور بروسلا آبورتوسS99وRB51در محيط کشت بروسلا آگار کشت مي گردد. سپس، سلول هاي کشت شده باPBSشسته شده و توده سلولي هر کدام جمع آوري مي گردد.OMPاز طريق روش سديم لوريل سارکوزينات از سويهRB51تخليص مي گردد و نيزLPS ، سويهS99از طريق روش فنل داغ اصلاح شده تهيه مي گردد. سپس با استفاده از EDAC وآديپيک اسيد دي هيدرازيد، ليپوپلي ساکاريد بهOMP کونژوگه مي گردد و پس از انجام آزمايشات کنترل کيفي، کونژوگه حاصل جهت آزمايشات ايمني زايي به خرگوش سفيد نيوزيلندي تزريق مي گردد و از سرم بدست آمده آزمايشاتSerum Bactericidal Assay به عمل مي آيد. نتايج حاصله يادداشت و براي تجزيه و تحليل هاي آماري به کار گرفته مي شوند.
فصل اوّل
کليات
مقدمه:
بروسلا ها کوکوباسيل هاي گرم منفي وغير متحرک اند که انگل اختياري دورن سلولي مي باشند.اين باکتري هاعفونت هاي سيستميک و خوني در انسان وحيوان ايجاد مي کنند(zoonosis).بروسلا بي هوازي اختياري بوده که کپسول ندارد. اين باکتري ها zoonosis بوده که در حيوانات اهلي به صورت منبع اصلي اين باکتري ها هستند وانسان ها ميزبان هاي اتفاقي هستند. بروسلا ها در انسان باکتريمي داده ومي توانند براي مدت طولاني در خون انسان باقي بمانند. جنس بروسلا براساس تنوع آنتي ژني وميزبان اوليه شامل7گونه ي (بروسلامليتنسيس) درگوسفندوبز،)بروسلاسوئيس (درخوك)،بروسلاآبورتوس (درگاو،) بروسلااويس (درگوسفند) بروسلاكانيس (درسگ)،،بروسلانئوتومه (درموش جنگلي و) بروسلاماريس (درپستانداران دريايي مي باشد.بروسلا در ميزبان حيواني خود بيماري شديدي ايجاد مي کند اماعفونت آنها در انسان ملايم است معمولا.در بيماري بروسلوز انساني(تب مواج يا تب مالت)دو مرحله وجود دارد يک مرحله حاد که بصورت باکتريمي حاد اتفاق افتاده وبه دنبال آن مرحله مزمن ايجاد مي شود که ممکن است سال ها طول کشيده بافت هاي مختلفي را درگير مي کند. اين باکتري ارگان هاي بسياري را مي تواند درگير كند. بروسلا آبورتوس از جمله مهم ترين عوامل سقط جنين به گاو است.دليل ايجاد سقط جنين در گاو علاقه مندي اين باکتري به الکل 3کربنه اريتريتول مي باشد از آنجا که در منطقه جفت گاو است باکتري در اين منطقه کلنيزه مي شود.چون انسان اريتريتول ندارد سبب سقط جنين نمي شود. 3 آنتي ژن سطحي در بروسلا شناسايي شده که 2 آنتي ژن توسط فرم S کلني شده و يک آنتي ژن توسط فرم R کلني توليد مي شود.Ag A که به طور غالب در بروسلا آبورتوس ديده مي شود.Ag M به طور غالب در ملي تنسيس ديده مي شود. سالانه 500.000 مورد مبتلا به تب مالت به WHO(سازمان جهاني سلامت)گزارش مي شود .بيماري تب مالت در انسان به3 شكل حاد، موضعي و مزمن بروز مي‌كند. بروسلا ملي تنسيس B. melitansis : منطقه مديترانه، امريكاي لاتين، كشورهاي حاشيه خليج فارس، هند يافت مي شود. بروسلا آبورتوس B. abortus : در تمام دنيا وجود دارد. بروسلا سوئيس B. Suis : ايالات متحده، جنوب آمريكا، جنوب شرق آسيا ، در ژاپن ، مركز اروپا و بخصوص شمال و جنوب امريكا بسيار شايع است. امروزه كنترل بيماري بروسلوز به سه اصل كشتن دام‌هاي آلوده، پاستوريزه كردن محصولات لبني و واكسيناسيون استوار است.واكسيناسيون دام‌ها برپايه تلقيح سويه‌هاي زنده ضعيف شده بروسلا آبورتوس (S19 , 45/20) و بروسلا ملي‌تنسيس (Rev1) است.استفاده از اين واكسن‌ها در دام با محدوديت‌هايي همراه است؛ تحريك توليد آنتي‌بادي در دام‌هاي واكسينه شده كه مانع از تفكيك آنها از دام‌هاي مبتلا مي‌گردد، همچنين بروز سقط جنين و ابتلا به بروسلوز در اين حيوانات، باعث شده تا تلقيح اين واكسن‌ها در دام‌ها با احتياط انجام گيرد. همچنين واكسن هاي بروسلوز انساني بر پاية پيكرة كامل باكتري غير فعال شده و يا سويه‌هاي زنده تخفيف حدت يافته با دو مشكل اساسي مواجه‌اند: نخست آنكه گاهي ايجاد بيماري مي نمايند و دوم آنكه با واكنش‌هاي ازدياد حساسيت‌ ناخواسته همراهند.
يافتن واکسن موثر براي مصون سازي بي خطر براي انسان و دام مبناي تحقيقات گسترده اي شده است.در همين راستا، در سال هاي اخير ايمني زايي با آنتي ژن هاي مختلفي از گونه هاي بروسلا به شکل مونووالان،طبيعي،کونژوگه وبا نوترکيب مورد مطالعه وبررسي قرار گرفته است(6،7).استفاده از اجزاي مختلف سلول بروسلا(LPS,Omp) که توانايي ايجاد پاسخ ايمني(همورال وسلولار) را داشته باشد وساخت واکسن هاي کونژوگه ي از نوع زير واحدي(subunit) که اين مشکلات ذکر شده را نداشته باشد،گامي موثر در پيشبرد اين اهداف دارد.(16)
فصل دوم
اهميت و ضرورت انجام تحقيق
واکسيناسيون اقدام بسيار مهم و با ارزشي است که به وسيله آن با هزينه کم، مي توان از ابتلاء به بيماري هاي عفوني جلوگيري کرد.به منظور پيشگيري از بروز و شيوع بيماري هاي عفوني ومسري بين انسان و دام ريشه کني،کنترل و مبارزه بابيماري ها از واکسن استفاده ميشود.براي اولين بار ايران در سال 1932 وجود بروسلوز در انسان توسط کارشناسان انسيتوپاستور مشخص گرديد.در سال 1962 وجود بروسلا ملي تنسيس در نيشابور به اثبات رسيد و در سال 1971 بروسلا سوئيس در حومه حصارک از خوک جداگرديد.در ايران اولين گزارش از جداسازي بروسلا آبورتوس از گوسفند به عنوان عامل سقط جنين در آن حيوان ،در س22ال 1982 توسط ذوقي وعبادي ارائه شد.
ايمن سازي بر ضد بروسلوز از حدود سال 1906 توسط واکسن هاي کشته شده آغاز گرديده ولي به علت اثرات مصونيت زاي ناکافي آنها هيچ گونه استفاده گسترده اي از اين واکسن ها صورت نگرفته است.از سال 1952 واکسن هاي زنده در اياات متحده و شوروي سابق مورد استفاده قرار گرفتند گرچه تاثير ناچيزي داشتند و واکنش هاي آلرژيک ايجاد ميکردند. معيارهاي عيني مفيد جهت ارزيابي احتمال وجود بروسلوز، شامل علائم فيزيکي،کشت وتست هاي سرولوژيک،مي باشد و آزمايشات خون طبيعي ، معمولا کمکي به تشخيص نميکند و حتي گاهي نيز گمراه کننده مي باشد.باتوجه به اينکه بيماري بروسلوز يک بيماري خطرناک مشترک بين انسان ودام است اکثر کشور هاي جهان سعي در ريشه کني کامل اين بيماري دارند و براي رسيدن به اين هدف از روش (تست و کشتار) براي دام هاي آلوده به بيماري و استفاده از واکسن براي پيشگيري ازاين بيماري استفاده ميکنند.مبارزه با اين بيماري کنترل وريشه کني آن بدليل کثرت گونه اي عوامل بيماري زا و لزوم هزينه شدن سرمايه هاي سنگين اقتصادي همواره در بسياري از کشور هاي جهان ، با دشواري ها و مشکلات عديده مواجه بوده است.
از بين عوامل ويرولانس اين ميکروارگانيسم، ليپوپلي ساکاريد به عنوان عامل ويرولانس اصلي شناخته شده است و سويه هاي جهش يافته و فاقد اين جزء از ديواره سلولي،فاقد ويرولانس و توان بقاي درون سلولي هستند.ليپوپلي ساکاريد به لحاظ ايمونولوژيک ،آنتي ژن سطحي سلولي، بروسلا محسوب ميشود و ميتوان از شاخص هاي ديگر آنتي ژني ديواره سلولي بروسلا ،براي مثال پروتئين هاي غشاي خارجي (Omp) و ليپوپلي ساکاريد به عنوان ايمونوژن در ساخت واکسن هاي زير واحدي استفاده نمود.بدليل اينکه بروسلا فاقد پيلي،فلاژن وکپسول مي باشد، بيشترين ميزان پاسخ هاي سيستم ايمني را ايجاد ميکند(19،1،3،12).در اين راستا، توليد واکسن کونژوگه ي بروسلا، باتوجه به معايب واکسن هاي قبلي وفوايد اين تحقيق، ما را به تهيه واکسن کنژوگه ي زير واحد ي مناسب و جديد، براي ريشه کني و پيشگيري بروسلوز در دام و انسان سوق مي دهد.
هدف از تحقيق:
اهداف جزئي اين تحقيق شامل:
تهيه و تخليص LPS بروسلا آبورتوس S99
تهيه و تخليص OMP بروسلا آبورتوس RB51
تهيه کونژوگه LPS بروسلا آبورتوس S99 با OMP بروسلا آبورتوس RB51 و
بررسي ايمني زايي همورال آن در حيوانات آزمايشگاهي
هدف کلي اين تحقيق:
بررسي ايمني زايي همورال واکسن کونژوگه LPS+Omp بروسلا آبورتوس S99 و RB51 به روش سرم باکتريوسيدال اسي(Serum Bactericidal Assay) مي باشد.
.1-2بروسلا وبروسلوزيس:
بروسلا ها در انسان باکتريمي داده ومي توانند براي مدت طولاني در خون انسان باقي بمانند. بقاي بروسلا در محيط هاي مختلف و فراورده هاي لبني 1 : آب: 57-1 روز2. خاك (رطوبت 90% ) : 73-48 روز 3. كود: 205-1 روز4. مواد زائد حيواني: 4-1 ماه 5.پشم: 110 روز.6 شير: در صفر درجه به مدت 24 ساعت الي 18 ماه .7خامه : 6-4 هفته.8 بستني: تا 30 روز .9كره: تا 142 روز.10 پنير: 3 ماه.11 گوشت نمك سود يا يخ زده: 12-3 ماه.
بروسلا سبب ايجاد تب مالت يا تب مواج يا تب دانگ ويا تب مديترانه اي در انسان مي شود. بروسلا ها به طور رايج از طريق خوردن محصولات لبني آلوده يا محصولات گوشتي آلوده به انسان انتقال مي يابد.جنس بروسلا براساس تنوع آنتي ژني وميزبان اوليه شامل7گونه ي (بروسلامليتنسيس) درگوسفندوبز،)بروسلاسوئيس (درخوك)،بروسلاآبورتوس (درگاو،) بروسلااويس (درگوسفند) بروسلاكانيس (درسگ)،،بروسلانئوتومه (درموش جنگلي و) بروسلاماريس (درپستانداران دريايي مي باشد.بروسلا در ميزبان حيواني خود بيماري شديدي ايجاد مي کند اماعفونت آنها در انسان ملايم است معمولا.در بيماري بروسلوز انساني(تب مواج يا تب مالت)دو مرحله وجود دارد يک مرحله حاد که بصورت باکتريمي حاد اتفاق افتاده وبه دنبال آن مرحله مزمن ايجاد مي شود که ممکن است سال ها طول کشيده بافت هاي مختلفي را درگير مي کند.اين باکتري ارگان هاي بسياري را مي تواند درگير كند، از جمله، در سيستم عصبي،مننژيت ، مننگوانسفاليت و بسياري بيماري هاي ديگر، در سيستم اسكلتي، اسپونديليت، درگيري استئوآرتيكولار در 20% تا 80% از موارد، در سيستم گوارشي، بروسلوز علائمي مشابه با تب تيفوئيد دارد، درگيري كبدي ايجاد مي كند، پانكراتيت وغيره نيز ايجاد مي كند. در سيستم قلبي-عروق مي تواندعامل اندوكارديت در كمتر از 2% موارد بكند، اما اين مقدار مرتبط با ميزان موارد منجر به مرگ مي باشد. در سيستم تنفسي،مي تواند برونشيت، نومونيا، آبسه ،و…رخ دهد.در سيستم ادراري-تناسلي، نفريت، گلومرولونفريت، پايلونفريت، اوركيت، آبسه كليوي، سقط جنين،و…رخ مي دهد.عفونت مزمن زماني رخ مي دهد كه، بيماري علي رغم درمان آنتي بيوتيكي، در ارگاني مثل طحال، كليه، مغز استخوان، دوام پيدا كند. در اين زمان، ميزان IgG بالا مي رود، و درمان شامل جراحي و تخليه محل عفونت مي باشد. در اين شرايط، تب به صورت عودكننده ديده مي شود. بروسلوز در كودكان نادر است . در همه سنين مي تواند ايجاد بيماري كند. داراي قابليت بقا يافتن و تكثير شدن در فاگوسيت هاي تخصصي و غير تخصصي مي باشند، وعامل سقط جنين در دام هاي اهلي هستند.بروسلا آبورتوس از جمله مهم ترين عوامل سقط جنين به گاو است.دليل ايجاد سقط جنين در گاو علاقه مندي اين باکتري به الکل 3کربنه اريتريتول مي باشد از آنجا که در منطقه جفت گاو است باکتري در اين منطقه کلنيزه مي شود.چون در انسان اريتريتول نداريم سبب سقط جنين نمي شود. رشد باکتري بر روي محيط هاي آزمايشگاهي کند بوده، اغلب در دماي 27 درجه سانتيگراد قبل از 48 ساعت محسوس نيست. در کشت هاي اوليه، بروسلا آبورتوس و بروسلا سوييس نياز به 5 تا 10 درصدCO2دارند(کاپنوتروف).آزمايش توليدH2Sهمراه با ساير خصوصيات براي تشخيص گونه هاي بروسلا مفيد است.3 آنتي ژن سطحي در بروسلا شناسايي شده که 2 آنتي ژن توسط فرم S کلني شده و يک آنتي ژن توسط فرم R کلني توليد مي شود.Ag A که به طور غالب در بروسلا آبورتوس ديده مي شود.Ag M به طور غالب در ملي تنسيس ديده مي شود.تشخيص قطعي بروسلوزيس علي رقم استفاده از تکنيک هاي کشت وسرولوژيک به عنوان يک معضل باقي مانده است. اميد يه رفع اين مشکل در سال هاي اخير با پيشرفت تکنيک هاي مولکولي قوت بيشتري گرفته است.(16،17)
شکل(2-1)- عفونت دريچه قلب توسط B.abortus .
2-1-1.تاريخچه:
بروسلوز بيماري عفوني ناشي از باکتريهايي است که اکنون به احترام David Bruce، کاشف اوليه ارگانيسم از طحال سربازان انگليسي تلف شده در جزيره مالت در سال 1887، بروسال ناميده ميشوند.
در سال Almroth Wright, 1897 و همکارانش آزمايش آگلوتيناسيون سرم را توصيف نموده که در شکل اصالح شده آن به عنوان متداولترين روش براي تشخيص بروسلوز شناخته شده است.
در سال M.Louis Hughes, 1897 شرح تجارب خود را در مورد بيماري در مالت(1890 تا 1896)منتشر نموده و سير “مواج” تب در انسان را بيان داشت.
در سال 1943،Forrest Hudleson ميکروبيولوژيست دامپزشک در دانشگاه ايالت ميشيگان، بروسالا ملي تنسيس را به عنوان کوکوباسيل هوازي، گرم منفي و بدون نياز به گاز CO2 جهت جداسازي اوليه توصيف نمود.
Cotton و schooeder ضمن بررسي باسيل سل گاوي براي اولين بار بروسالاآبورتوس را از شير گاوهاي در 1911 جدارکرد.(23)
در ايران در سال 1311 از کشت خون انسان، بروسال ملي تنسيس در انستيتو پاستور ايران جداشد.در سال 1323 از جنين گاو بروسال آبورتوس در مؤسسه تحقيقاتي واکسن وسرم سازي رازي جداشد.در سال 1329 از شير بز و گوسفند، بروسال ملي تنسيس در مؤسسه تحقيقاتي واکسن و سرم سازي رازي جدا شد.در سال 1350 بروسال سوئيس از خوک در مؤسسه تحقيقاتي واکسن و سرمسازي رازي جداشد.

2-1-2.وضعيت بيماري در ايران:
تعيين ميزان شيوع بيماري تب مالت بدليل عدم گزارش کامل موارد بيماري مشکل است ولي با وجود سيستم مراقبت، گزارشات جاري مي تواند مبين روند ميزان بروز واقعي بيماري باشد. با بررسي تعداد و ميزان بروز بيماري در کشور، بيماري از سال 1359 لغايت 1368 رو به افزايش بوده است و از سال 1368 لغايت 1389 با شروع برنامه هاي اول و دوم توسعه از 170 مورد در صدهزار نفر به حدود 15/9 در صد هزار نفر رسيده است و بدنبال ارتقاء سيستم مراقبت و گزارش دهي بيماري روند نسبتاً رو به افزايش بيماري از سال 1378 لغايت1384 وجود داشته است و از سال 1385 بدنبال موفقيت در افزايش پوشش واکسيناسيون دام ها روند بيماري رو به کاهش بوده است.
ايجاد هماهنگي بين بخشي، استاندارد کردن تعاريف بيماري، آموزش جامعه و کارکنان بهداشتي، افزايش گزارش دهي، افزايش کارخانجات توليد فرآورده هاي لبني پاستوريزه، افزايش پوشش واکسيناسيون دامي ازعوامل مؤثر در کنترل و پيشگيري بيماري در دام و نهايتا در انسان مي باشد(18).
بيماري در تمامي سنين وجود دارد ولي وفور آن در سنين 20-30 سالگي مي باشد، يعني نيروي فعال و کارآمد کشور در معرض خطر اين بيماري هستند.
بيماري در هر دو جنس ديده ميشود ولي با اختالف کمي در جنس مذکر( 55/4 درصد) بيشتر از جنس مؤنث( 44/6 درصد) ديده ميشود.
بيماري را نميتوان انحصاراً يک بيماري شغلي محسوب نمود ولي شغل به عنوان يک عامل خطر در ابتال به بيماري مطرح است بخصوص نزد خانمهاي خانهدار(خانم هاي خانه دار عمدتاً به عنوان دامدار و کشاورز دوشادوش همسرانشان در مناطق روستايي به فعاليت مي پردازند)، دامداران و کشاورزان.
بيماري در تمام فصول وجود دارد اما در فصل بهار و تابستان همزمان با فصل زايش و شيردهي دامها بيشتر ديده ميشود.
بيماري در منطقه روستايي(77 درصد) بيشتر از منطقه شهري (23درصد) مي باشد که مرتبط با تماس با دام آلوده و استفاده از فرآورده هاي لبني غيرپاستوريزه در مناطق روستايي مي باشد.(18)
2-1-3.انتشار بروسلوز در جهان:
تخمين شيوع واقعي بروسلوز انساني در جهان به علت عدم گزارش کامل بيماري در بسياري از کشورها، غيرممکن است. اين وضعيت براي هر دو گروه کشورهاي پيشرفته و در حال توسعه صادق مي باشد. با وجودي که بروسلوز گاوي در بسياري از کشورهاي پيشرفته ريشه کن شده يا تحت کنترل قرارگرفته، ليکن شيوع آن در بسياري از کشورهاي در حال توسعه، عليرغم پيشرفت صنايع شير با حداقل امکانات دامپزشکي، افزايش يافته است. وضعيت مشابهي در سطح محدودتر براي بروسلوز گوسفندي، بزي و خوکي اتفاق افتاده است.با توجه به مخاطره بيشتر در دو نوع اخير نسبت به عفونت بروسال آبورتوس براي بهداشت انساني، در نتيجه
افزايش تعداد موارد بروسلوز انساني در سطح جهان قابل تصور است. کشورهاي عاري از بروسلوز براساس آخرين يافته ها در کشورها چنين است(18):
کشورسال اعلام ريشه کنيجزاير مانش1935نروژ1952سوئد1957فنلاند1960دانمارک1962سوئيس1963چک و اسلواکي1964روماني1969اسکاتلند1980انگلستان و ولز1981هلند،اتريش،لوکزامبورگ،بلغارستان،ژاپن و قبرس1985جزاير فارکلند1994جدول(2-1)کشور هاي عاري از بروسلوز
2-2.اهميت مراقبت بروسلوز ) بيماري تب مالت(:
بروسلوز(بيماري تب مالت) در انسان نشان دهنده گسترش بيماري در حيوانات است. معمولا عفونت در انسان به تماس مستقيم با حيوانات آلوده يا فرآورده هاي آنها وابسته است.تماس با حيوانات دچار سقط جنين و مصرف شير آلوده يا فرآورده هاي آن مخاطرات اصلي مي باشند.
در سطح جهاني، اکثر موارد بروسلوز انساني در نتيجه بروسالا ملي تنسيس اتفاق افتاده که مهاجم ترين و بيماري زا ترين گونه در بين گونه هاي جنس بروسالا ميباشد. معموالا عفونت ناشي از بروسالا آبورتوس در انسان خفيف تر بوده و بروسالا کنيس کم ترين تهاجم را از بين چهارگونه براي انسان دارد و بروسالا سوئيس بيماريزايي زيادي داشته و غالبا عوارض شديدي چون آبسه هاي بافتي عمقي را موجب ميگردد.
عفونت هاي انساني ناشي از باکتري هاي بروسالا هميشه بيش از موارد مبتالا با علائم باليني مي باشد. نسبت موارد بدون علامت به باليني بروسلوز ممکن است 8 به 1 و يا بالاتر باشد(23).
به علت عدم وجود اطلاعات کافي از وقوع بيماري در انسان وحيوانات در بسياري از کشورها، يا بدليل فقدان تسهيلات تشخيصي و گزارشي، تخمين دقيق از ميزان شيوع بروسلوز در سطح جهاني وجود ندارد.علاوه بر اين، بسياري از موارد بروسلوز در انسان خفيف بوده يا با تظاهرات باليني غيرمعمول همراهي شده که به درستي تشخيص داده نمي شود.
در اکثر موارد، تعريف بروسلوز حاد يا مزمن بدليل نشانه هاي باليني مختلف مطرح ميشود. گاهي شواهد سرولوژي بروسلوز در افرادي بدون تاريخچه اي از علائم بيماري ديده شده، که بدليل توليد آنتي بادي هاي ناشي از تماس با بروسالا و بدون ايجاد تظاهرات باليني بوده است. بطور معمول اين وضعيت در افرادي با سابقه تماس با حيوانات بيمار مشاهده ميگردد. بديهي است که علائم باليني خفيف در چنين بيماراني مورد توجه قرارنگيرد(23).
اکثر بيماران مبتالا به بروسلوز علائم غيراختصاصي ناراحتي سيستم عصبي، چون سردرد، رخوت،افسردگي نشان مي دهند. مشخص ترين و شناخته شده ترين سندرم بروسلوز عصبي، مننژيت با يا بدون تغيير در آگاهي و در نتيجه تهاجم مستقيم بروسلوز به سيستم اعصاب مرکزي(CNS) مي باشد. درگيري مستقيم نخاع شوکي عارضه غيرمتداول بروسلوز است، عوارض ديگر بروسلوز در نتيجه درگيري ديگر بافت ها چون دريچه هاي قلبي، استخوان ها و مفاصل اتفاق مي افتد. بروسلوز انساني با شکايات غيراختصاصي، چون درد پشت و دردهاي مفصلي مشابه تب روماتيسمي مشخص ميگردد. درگيري کبد در بروسلوز در مراحل ابتدايي وجود دارد و غيرطبيعي بودن نمونه کبد پس از مرگ ثابت شده است.
بيماران مبتالا به بروسلوز، باکتري را از طريق ادرار دفع نموده، که ممکن است مدت زيادي بعد از برطرفشدن علائم باليني طول بکشد. اندوکارديت عفونت ناشي از بروسالا نادر بوده. اما عارضه بالقوه کشنده اي است.
در سال 1897،Hughes انتقال بروسلوز را از طريق هواي آلوده با باکتري هاي موجود در خاک آغشته به مدفوع حيوانات عفوني پيشنهاد نمود. در زمان شرح اوليه بيماري در انسان، لوله گوارش به عنوان راه ورود بروسالا شناخته شده است. شير آلوده حيوانات و فرآورده هاي غيرپاستوريزه تهيه شده از آن متداولترين منشاء انتقال دهاني بروسالا بوده، هرچند که گوشت خوب پخته نشده نيز به عنوان منشاء بالقوه بروسلوز غذايي ذکر شده است. آلودگي از طريق پوست روش متداول عفونت با بروسالا بوده، هرچند که تظاهرات پوستي بروسلوز کمياب هستند. انواع ضايعات چشمي در بيماران مبتالا به بروسلوز توصيف شده اما غالبا رابطه آنها با عفونت بروسالا مبهم است.
کنترل بروسلوز به حذف و ريشه کني بيماري در منشاء آن، يعني حيوانات وابسته است.
سازمان دامپزشکي کشور به عنوان متولي اصلي طي ساليان متمادي برنامه مبارزه با بروسلوز را در قالب طرح هاي ملي مبارزه با سل و بروسلوز در دستور کار داشته است. امکانات و منابع موجود براي اجراي مبارزه با بروسلوز دامي در حدي است که تنها ميتوانند با حفظ وضع موجود به فعاليتهاي خود ادامه دهند و امکان توسعه فعاليت ها براي هدف حذف و ريشه کني بيماري در حال حاضر ميسر نخواهد بود که دلايل آن شامل موارد زير است:
* پايين بودن ميزان اعتبارات و منابع مورد نياز طرح مبارزه با بروسلوز در اجراي برنامه هاي واکسيناسيون دامي، تست و کشتار و پرداخت غرامت به صاحبان دام.
* کم توجهي به برنامه هاي مبارزه با بيماريهاي قابل انتقال بين انسان و حيوان در مجموعه اولويت ها و سياست هاي مسئولين ذيربط.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

* ناکافي بودن همکاري ساير سازمانها در اجرايي شدن اهداف کنترل و پيشگيري بيماري.
* ناکافي بودن همکاري رسانه هاي همگاني در ارتقاء آگاهي جامعه.(18)
2-3.عامل بيماري:
4 نوع بروسالا به عنوان عامل اکثر عفونتهاي بروسلوز (بيماري تب مالت) در انسان تشخيص داده شده است(19):
2-3-1. بروسال ملي تنسيس Brucella Melitensis (داراي 3 سروتايپ):
اکثر موارد عفونت بروسالا ملي تنسيس در ارتباط با تماس مستقيم و غيرمستقيم با گوسفند يا بز آلوده و يا فرآورده هاي آنها مي باشد.ديگر انواع ميزبانان منجمله گاو و شتر منابع قابل اهميتي در برخي نواحي بوده اما احتمالا مسئول تعداد کمي از عفونت ها مي باشند. بر طبق تعداد موارد گزارش شده و همچنين در ارتباط با شدت بيماري، بروسالا ملي تنسيس مهمترين عامل بروسلوز انسان بوده، هرچند انتشار جغرافيايي آن محدودتر از بروسالا آبورتوس است(20).
سروتايپ 1 بروسالا ملي تنسيس به عنوان تايپ بومي ايران شناخته شده است.
2-3-2. بروسالا آبورتوس Brucella Abortus (داراي 7 بيوتايپ):

شکل(2-2)بروسلا آبورتوس داراي منشاء گاوي
بروسالا آبورتوس کمتر از بروسالا ملي تنسيس براي انسان بيماريزا بوده و نسبت بيشتري از عفونت ها خفيف يا بدون علامت بوده است. گاو مهمترين منشاء عفونت بوده اما ديگر انواع حيوانات مانند گاوميش، شتر و گاو کوهان دار تبتي ميتوانند از اهميت محلي برخوردار باشند. گاهي موارد شيوع عفونت بروسالا آبورتوس در گله هاي گوسفند در نتيجه تماس با گاوهاي آلوده اتفاق ميافتد.
بيوتايپ3 بروسالا آبورتوس به عنوان تايپ بومي ايران شناخته شده است.
2-3-3. بروسالا سوئيس Brucella Suis (داراي 5 بيوتايپ):
عامل سقط جنين خوک است. عفونت بروسالا سوئيس انتشار جغرافيايي محدودتر از بروسالا آبورتوس يا بروسالا ملي تنسيس داشته و هر يک از بيوتايپ هاي آن خصوصيات ويژه اي دارند، اکثر عفونت هاي انساني منتقله از خوک به وسيله بيوتايپ هاي 1و3 بروسالا سوئيس اتفاق مي افتد.
شکل(2-3) بروسلا سوئيس داراي منشاء خوک
2-3-4. بروسالا کنيس Brucella Canis:
ميزبان اختصاصي بروسالا کنيس سگ است و بيماري زايي کمي براي انسان دارد. موارد باليني عفونت تشخيص داده شده و بررسي هاي سرولوژي مؤيد آن است که عفونت هاي بدون علامت انسان در نواحي که بيماري در سگ شايع است، متداول مي باشد.
2-3-5. بروسالا اوويس Brucella Ovis:
ميزبان اصلي آن گوسفند است و بيماري زايي آن براي انسان شناخته نشده است.
2-3-6. بروسالا نئوتومه Brucella neotoma:
درموش صحرايي و يک منطقه جغرافيايي در آمريکا شناسايي شده است.
شکل(2-4) بروسلا سوئيس داراي منشاء موش صحرايي
2-3-7. بروسالا ماريس Brucella Maris:
در سال 1994 از الشه هاي پستانداران دريايي در سواحل اسکاتلند و يک دولفين در کاليفرنيا جدا گرديد.شواهد مؤيد آن است که اين باکتري قادر به ايجاد بيماري در انسان ميباشد از اين رو بايستي به عنوان عوامل بالقوه عفونت در بيماراني با تاريخچه تماس با پستانداران دريايي يا نسوج آنها درنظرگرفته شود(20).
شکل(2-5) بروسلا سوئيس داراي منشاء پستانداران دريايي
2-4. مورفولوژي:
بروسلاها باکتريهاي کوکوباسيل گرم منفي کوچک، باريک و کوتاهي هستند، که گاهي به شکل باسيل و يا کوکسي نيز مشاهده مي شوند. طول متغيري حدود 5/1 – 6/0 ميکرومتر و عرض 7/0 – 5/0 ميکرومتر دارد. غير متحرك و هوازي مطلق بوده و اسپور و کپسول،پلاسميد،تاژک،پيلي و اگزوتوکسين توليد نمي کند. از منابع طبيعي شکل L -form آن نيز جدا شده است.
مقاومت در برابر رنگ بري بوسيله محلول هاي رقيق اسيدي و قليايي امکان به کار گيري، رنگ آميزي هاي متفاوت و غير اختصاصي را در بافت هاي آلوده، از قبيل زيل نيلسون اصلاح شده , ماشياولو و روش کوستر فراهم کرده است.ايزوله هاي کلينيکي به آرامي رشد مي کنند و در طي 10 – 5 روزکلوني هايي توليد مي کنند .بروسلاها فعاليت پرتئوليتيکي ضعيفي دارند و نمي توانند ژلاتين را هضم يا گلبول هاي قرمز را تخريب کنند. بروسلاها نسبت به نور،حرارت،مواد ضدعفوني کننده حساس ند،اما در خاک،مدفوع،رطوبت و سايه مقاومت دارند و قادرند در خارج از سلول تا مدت ها زنده بمانند.اين باکتريها در محيط هاي غني قابل تکثيرند.رشد تعدادي از گونه هاي آنها با وجود پنتوتنات کلسيم،اريتريتول و گازکربونيک10-5 درصد تسريع مي شود.بروسلاها انگل اختياري درون سلولي هستند.اين باکتري ها پس از ورود به لکوسيت ها در داخل اين سلول ها تکثير مي يابند و پس از رها شدن، از طريق مجاري لنفي و خون در سيستم رتيکولواندوتليال نظير کبد،طحال،قلب،ريه،بيضه و استخوان جايگزين مي شوند. تمايل زياد اين باکتري ها به جايگزيني در رحم حيوان احتمالاً به دليل وجود اريتريتول در اين اندام است( 6، 8،10، 30).
2-4-1. شاخص هاي ويرولانس:
ايزوله هاي اوليه بروسلا مورفولوژي صاف ( S ) دارند،اما ايزوله هاي ساب کالچر شده مورفولوژي خشن ( R ) دارند.اگرچه واژه هاي صاف و خشن براي توصيف تغييرات کپسول دار شدن در باکتري هاي ديگر مي باشد ولي بروسلا کپسول ندارد.در عوض تغييرات در بروسلا تغييرات در غشاي خارجي مي باشد .تغيير اين شکل از S به R به نظر مي رسد پاسخي به تجمع D – آلانين ترشحي توسط اشکال S و يا کاهش ميزان PO2( فشار اکسيژن ) محيط در طي رشد بروسلا باشد. به نظر مي رسد اشکالS بهتر از اشکال R درون فاگوسيت ها زنده مي مانند(9، 24، 31،40).
2-4-2. ژنتيک:
ژنوم بروسلا37/2ميليارد دالتون وزن دارد و به استثناي بيووار 3 بروسلا سوئيس که يک کروموزوم حلقوي Mb1/3 دارد،محتواي ژنومي ساير اعضاي جنس بروسلا شامل دو کروموزوم حلقوي 1/ 2 و 5/1 مگابازي است که هر دو براي بقاء و همانند سازي باکتري ضروري مي باشند. C+G= %58-% 59مي باشد. مطالعه هاي انجام گرفته براساس هيبريداسيون DNA-DNAنشان از وجود تشابه ژنومي بسيار بالا در بين اعضاي اين جنس دارد، به طوري که همساني توالي DNA آنها بيش از 95 % است. همچنين نشان داده است که DNA بروسلا 30 % مشابه با اکروباکتروم است.ژنomp36 که پروتئين گروه دوم غشاي خارجي بروسلا را توليد مي کند،مسئول رنگ پذيري افتراقي بيوتايپ هاي اين جنس باکتري است.ساختارDNA در بروسلاها از تشابه زيادي برخوردار است.درDNA بروسلا آبورتوس يک افتادگي به طول10کيلوباز ديده مي شود.بخشي از اين افتادگي مربوط به محل ژني به نامomp31 است که پروتئيني با نقش احتمالاً پوريني توليد مي کند.اين پروتئين در تمام گونه هاي بروسلا غيراز بروسلا آبورتوس ديده مي شود( 6، 32، 36،39، 38).
2-5. راه هاي سرايت بيماري:
1.تماس مستقيم از راه ملتحمه چشم (کونژنکتيو)، يا از طريق تماس خراش ها و جراحات پوست با ترشحات، مواد دفعي، يا بافت هاي حيوانات آلوده يا اشياء آغشته به ترشحات عفوني.
2.مصـرف بافت ها، مواد غذايي يا مايعات حـاوي باکتري بروسلا مانند:شير خام و فرآورده هاي لبني خصوصاً پنير تازه، خامه و سرشير، موارد بروسلوز انساني ناشي از گوشت و فرآورده هاي آن کمتر از استفاده از فرآورده هاي لبني آلوده مي باشد. با اين وجود گوشت، اعضاء و خون تمامي انواع حيوانات ممکن است حاوي بروسالا باشد.
3.انتقال تنفسي از طريق استنشاق ذرات عفوني معلق در آغل، اصطبل و آزمايشگاه:
انتقال بروسلوز از انسان به انسان بسيار نادر است.تلقيح مصنوعي، واکسيناسيون و نمونه برداري از خون دربرنامه هاي خونگيري از گاو به موارد متعدد بروسلوز در بين دامپزشکان و تکنسين ها منجرشده است(21).
2-5-2. دوره نهفتگي:
وقتي که برخورد با منبع عفونت مستمر باشد، چه از راه نوشيدن شيرخام و يا تماس شغلي،تعيين زمان دقيق آلودگي و لذا دوره نهفتگي مشکل خواهد بود. اما در مواردي که عفونت بدنبال يک تماس مشخص باشد، دوره نهفتگي اغلب بين 1 تا 3 هفته ميباشد. گاهي اوقات بين 6 تا 17 ماه نيز گزارش شده است.(18)
2-6. علائم بيماري:
بطورکلي بيماري به صورت حاد يا موذيانه(insidious) شروع شده و با تب مداوم يا منظم با دوره هاي متناوب، تعريق فراوان بخصوص در شب، خستگي، بي اشتهايي و کاهش وزن، سردرد، درد عضالني و درد عمومي بدن تظاهر ميکند.
علائم بيماري تا حد زياد وابسته به نوع بروسالا است و بر اساس شدت بيماري به اشکال حاد، تحت حاد، مزمن و موضعي بروز مي نمايد.
2-6-1. نوع حاد: در اين شکل بيمار گرفتار لرز ناگهاني، درد عمومي بدن بخصوص درد پشت بوده و عرق شديد دارد. بيمار اشتهاي خود را از دست داده و از ضعف و سستي شکايت دارد.
2-6-2. نوع تحت حاد: اغلب اوقات حالت تب دار اوليه وجود نداشته و آغاز آن بي سروصدا مي باشد ولي گاهي بدنبال مرحله تب دار حاد شروع مي شود. شکايت اصلي بيمار از ضعف و خستگي است.
2-6-3. نوع مزمن: غالبا علائم بعد از يک دوره تب دار براي سال ها باقي مي ماند
2-6-4. نوع لوکاليزه (موضعي): باکتري هاي بروسلوز مي توانند در اعضاء مختلف بدن ايجاد عفونت موضعي نمايند، شايعترين اعضاء مبتالا شامل استخوان ها، مفاصل، سيستم اعصاب مرکزي(CNS)، قلب، ريه، طحال، بيضه ها، کبد، کيسه صفرا، کليه ها، پروستات و پوست مي باشند. ممکن است عفونت موضعي بطور همزمان درچند محل نيز ايجاد شود، اين شکل بيماري در اغلب موارد در ارتباط با نوع مزمن بيماري است، اگرچه به عنوان يکي از عوارض شکل حاد بيماري بدليل بروسالا ملي تنسيس يا بروسالا سوئيس مطرح است.(18)
2-7-1. تشخيص آزمايشگاهي بيماري:
معيار تشخيص آزمايشگاهي مبتني بر موارد زير است:
الف:جداکردن عامل (گونه هاي بروسلا) از نمونه هاي باليني در محل کشت؛
ب: تيتر آگلوتيناسيون بروسلا (STAT > 1/80 ) يا آزمايش سروآگلوتيناسيون در يک يا چند نمونه از سرمي که بعد از شروع علائم تهيه شده باشد، يا افزايش چهار برابر و يا بيشتر تيتر آگلوتيناسيون بروسلا به فاصله 2 هفته بعد از آزمايش اوليه؛
ج: آزمايش ME 2 > 1/40 (2- مرکاپتو اتانول)
د: آزمايش کومبس رايت (Coombs Wright) با فاصله 3 رقت بالاتر از رايت انجام شده (معمولاٌ ايـن مرحله در نمونه هاي با رايت ضعيف و منفي بيشترين ارزش را دارد)(تصميم گيري در مورد درمان بيمار با نتيجه تيترکومبس رايت و بررسي علائم باليني و اپيدميولوژيک به عهده پزشک مي باشد).
موارد (الف، ج و د) به عنوان معيارهاي تشخيص قطعي بيماري تلقي ميگردد.
به منظور يکنواخت کردن نحوه تشخيص آزمايشگاهي در مراکز بهداشتي درماني، آزمايشگاه هاي دولتي و خصوصي در سراسر کشور روش هاي آزمايشگاهي زير بدين ترتيب توصيه ميشود:
بدليل احتمال توزيع نامناسب و عدم نگه داري صحيح آنتي ژن رزبنگال، پس از شک باليني و درخواست آزمايش توسط پزشک، مستقيما بر روي نمونه سرم بيمار روش آزمايش لوله اي رايت (1 تا 8 لوله) (Wright. T) که با نام هاي استاندارد تيوب آگلوتيناسيون تست (S.T.A.T) ، سرم آگلوتيناسيون تست (S.A.T) نيز ناميده مي شود، توصيه مي گردد و در اين صورت نيازي به آزمايش رزبنگال نمي باشد و براساس نتايج آزمايش رايت لوله اي تصميمات ذيل اتخاذ ميگردد:
1ـ تيتر رايت مساوي يا بيشتر از 1/80 معرف حاالت زير است:
1-1 . وجود بيماري حاد
1-2. وجود بيماري مزمن
1-3 . مثبت کاذب ناشي از واکنش متقاطع بين بروسلاها و ساير ارگانيسم ها مثـل بعضي از جنس هاي اشريشيا، سالمونلا، پاستورلا، يرسينيا، ويبريوکلرا و کمپيلوباکتر که به منظور تفکيک سه حالت فوق از آزمايش2ME(2_ مرکاپتواتانول) استفاده مي شود.
الف: آزمايش ME 2 با تيتر مساوي و بيشتر از 1/40: معرف بيماري فعال بوده و نياز بـه درمان دارويي دارد.
ب: آزمايش ME 2 با تيتر کمتر از 1/40 معمولاً بيماري فعال نيست.
2ـ تيتر رايت کمتر از 1/80 معرف حاالت زير است:
1ـ2 . عدم وجود بيماري
2ـ2. احتمال وجود آنتي بادي هاي بلوکان که در اين صورت بايستي آزمايش تيترکومبس رايت(Coombs Wright) انجام گيرد.
الف: تيتر کومبس رايت با رقت 3 برابر بالاتر از رايت به عنوان بيماري فعال تلقي ميگردد.
ب: تيتر کومبس رايت با رقت کمتر از 3 برابر رايت معمولا بيماري فعال نيست.


پاسخ دهید