صفحه
35
36
37
38
49
50
52
53
54
55
56
56
57
58
58
59
59
60
60

61
62
63
64عنوان
جدول2-1: دستگاه‌هاي مورد استفاده
جدول2-2: انواع مواد شيميايي مورد استفاده
جدول2-3: انواع ميکروارگانيسم‌هاي مورد استفاده
جدول2-4: آنتي بيوتيک‌هاي مورد استفاده
جدول3-1: مقايسه بازده استخراج ترکيبات فرار
جدول3-2: ترکيب درصد اجزاي فرار در شوکران باغي
جدول3-3: ترکيب درصد اجزاي فرار در خار عروس
جدول3-4 : مقايسه بازده عصاره‌گيري
جدول3-5: درصدهاي مهار DPPH براي هر غلظت از نمونه استاندارد BHT
جدول3-6: نتايج آزمون DPPH براي نمونه استاندارد BHT
جدول3-7 : درصدهاي مهار DPPH براي هر غلظت از عصاره اندام هوايي خار عروس
جدول3-8 : نتايج آزمون DPPH براي اندام هوايي خار عروس
جدول3-9: درصدهاي مهار DPPH براي هر غلظت از عصاره ساقه و برگ شوكران باغي
جدول3-10: نتايج آزمون DPPHبراي عصاره عصاره ساقه و برگ شوكران باغي
جدول3-11: درصدهاي مهار DPPH براي هر غلظت از عصاره ميوه شوكران باغي
جدول3-12: نتايج آزمون DPPHبراي عصاره ميوه شوكران باغي
جدول3-13: درصدهاي مهار DPPH براي هر غلظت از عصاره ميوه فاقد چربي شوكران جدول3-14: نتايج آزمون DPPH براي عصاره ميوه فاقد چربي شوكران باغي

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

جدول3-15: نتايج آزمون DPPH عصاره گياه خار عروس و عصاره هاي شوكران باغي
جدول3-16: جذب مربوط به غلظت‌هاي متفاوت گاليک‌اسيد
جدول3-17: محتواي فنولي عصاره‌هاي گياهي
جدول3-18: درصد مهار لينولئيک اسيد عصاره هاي گياهي
جدول3-19 : نتايج مربوط به تعيين فعاليت ضدميکروبي عصاره‌هاي گياهي
علايم و اختصارات
Isoprenyl diphosphate
Dimethylallyl diphosphate
Mevalonic acid
1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate
2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate
Geranyl pyrophosphate
Neryl pyrophosphate
Farnesyl pyrophosphate
Phenyl alanine ammonialyase
Simultaneous distillation-extraction
parts-per-billion
Deoxy ribonucleic acid
Adenosine triphosphate
Folin-Ciocalteu Reagent
potential of Hydrogen
2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl
half maximal inhibitory concentration
Gas Chromatography
Flame Ionization Detector
Gas chromatography- Mass Spectrometry
direct current
alternating current
Retention Time
Kovats Index
National Cancer Institute
Minimum Inhibitory Concentration
Disk Diffusion
Ultraviolet-Visible
Dimethyl Sulfoxide
Butylated hydroxytoluene
Colony-forming unit
International Unit
National Committee for Clinical Laboratory Standards
Brain-heart infusion
Sabouraud dextrose agar
Potato dextrose agar
Nutrient agar
median Lethal Concentration
Ferric reducing antioxidant power
Thiobarbituric acidIPP
DMAPP
MVA
DXP
MEP
GPP
NPP
FPP
PAL
SDE
ppb
DNA
ATP
FCR
pH
DPPH
IC50
GC
FID
GC-MS
dc
ac
RT
KI
NCI
MIC
DD
UV-Vis
DMSO
BHT
CFU
I.U.
NCCLS
BHI
SDA
PDA
NA
LC50
FRAP
TBA
فصل اول
مباحث نظري
مقدمه
گياهان دارويي از سابقهاي بسيار درخشان به ويژه درکشورهاي باستاني مانند چين، يونان، مصر، ايران و هندوستان برخوردار است. در ايران باستان استفاده از گياهان به عنوان دارو، ضدعفوني کننده و معطرکننده مرسوم بوده است [1].
تاريخ اسانس‌ها از شرق آغاز شد. فن اسانس‌گيري به روش تقطير در مشرق زمين به خصوص در مصر، ايران و هندوستان پي‌ريزي و اجرا شد [2]. خدمات علما و دانشمندان مسلماني نظير جابربن‌حيان، زکرياي‌رازي، ابونصرفارابي، ابوعلي‌سينا که سرآمد علوم شيمي، پزشکي وداروسازي عصر خود بودند؛ به اندازه اي است که هنوز هم جوامع انساني از پرتو آنها در زمينه‌هاي مذکور استفاده مي‌کنند. شايد اولين داروخانه گياهي در قرن سوم هجري در بغداد شکل گرفت. اما به دليل اينکه تا آن زمان دانش بشري فاقد معيارها و استانداردهاي لازم براي تشخيص درست گونه‌هاي گياهي بود، گاهي گونه‌ها و گياهان متعددي با يک عنوان ولي با خواص متفاوت به مردم ارائه مي‌شدند. بعدها مواد مؤثر موجود در گياهان دارويي جايگزين مواد خام گياهي گرديد و به تدريج باب شيمي گياهي گشوده شد تا اينکه امروزه تعداد زيادي از داروهاي مدرن از منابع گياهي استخراج مي‌شوند [3].
کيمياگران اسانس را جوهره گياه ناميدهاند و بر اساس اين تفکر اسانس شکل مادي نيروهاي حياتي و روحي موجود در گياهان است. با گسترش اين علم، استخراج اسانس مورد توجه بيشتر قرار گرفت و به همراه عصارههاي گياه، قرنها به عنوان پايه بيشتر داروها و يا به تنهايي به عنوان دارو جهت درمان بيماريهاي مزمن و همگاني بکار ميرفتند [4].
کشور ما در زمينه درمان گياهي و استفاده از گياهان دارويي تاريخ و پيشينه‌اي درخشان دارد. با وجود اين، آن‌چنان‌که شايسته است، حاصل قرن‌ها تجربيات گذشتگان را ارج ننهاده‌ايم. با توجه به اينکه کشور ايران از ذخيره غني گياهي برخوردار است و بسياري از گياهان اين سرزمين از لحاظ قابليت‌هاي مختلف فيتوشيميايي، ضدميکروبي، دارويي و غيره مورد بررسي قرار نگرفته لذا شايسته است قابليت گياهان بکر آن ارزيابي شود که دو گياه Morina persica L. و Physospermum cornubiense (L.) DC. از اين جمله مي باشند.
1-1- ترکيبات طبيعي
سال‌هاست که منشأ، خواص و فوايد مربوط به فرآورده‌هاي طبيعي توجه پژوهشگران را به خود معطوف کرده است.فرآورده‌هاي طبيعي معمولاً به دو دسته‌ي بزرگ متابوليت‌هاي اوليه و متابوليت ثانويه تقسيم مي‌شوند. متابوليت‌هاي اوليه متشکل از مولکول‌هاي لازم و ضروري براي زندگي هستند و عمدتاً شامل پروتئين‌ها، کربوهيدرات‌ها، چربي‌ها و نوکلئيک اسيدها مي‌باشد. اين مولکول‌ها از مسيرهاي متابوليکي که در بيشتر موجودات زنده رايج هستند، تشکيل مي‌شوند. از اين رو مسيرهاي متابوليت اوليه مرتبط با فرايندهايي هستند که موجب سنتز، تجزيه، و تبديل اين متابوليت‌هاي اوليه مي‌گردد.در مقابل، فراواني متابوليت‌هاي ثانويه معمولاً کمتر است و اغلب منحصر به گونه‌هاي خاصي مي‌باشند [6]. در بيشتر موارد، ترکيبات طبيعي به متابوليت‌هاي با جرم مولي کمتر از 2000 واحدجرم اتمي اطلاق مي‌شود که براي ادامه حيات موجودات زنده ضروري نيستند ازجمله ؛ آلکالوئيدها، فلاونوئيدها، کومارين‌ها، گليکوزيد‌ها، ليگنان‌ها، استروئيدها و غيره [7]. ترکيبات طبيعي را براساس ساختار مولکولي، فعاليت فيزيولوژي، کموتاکسونومي و مبدأ بيوسنتز مي‌توان تقسيم‌بندي کرد [8].
1-1-1- آلکالوئيد
گياهان حاوي آلکالوئيد گستره وسيعي از داروها را در بر ميگيرند. آلکالوئيدها از نظر ساختمان شيميايي اختلاف زيادي با هم دارند ولي وجود يک ازت بازي وجه مشترک تمامي آنها ميباشد. آلکالوئيدهاي معمول که از گياهان به دست ميآيند، نوعي ترکيب بازي هستند که داراي يک يا بيش از يک اتم ازت ( معمولاً در حلقهي هتروسيکل ) ميباشند. اين ترکيبها داراي اثرات فيزيولوژيک برجستهاي روي انسان و حيوان ميباشند [9].
دو دسته کلي از آلکالوئيدها وجود دارند:
1-آلکالوئيدهاي غيرهتروسيکل يا آلکالوئيدهاي نامعمول و غيرشاخص که گاهي اوقات آنها را پروتو‌آلکالوئيد يا آمين‌هاي بيولوژيک مي‌نامند.
2-آلکالوئيدهاي هتروسيکل يا آلکالوئيدهاي معمول و شاخص که برمبناي ساختار حلقوي طبقه‌بندي مي‌شوند.
1-1-2- فلاونوئيدها
فلاونوئيدها ترکيبات پلي فنول شامل 15 کربن با دو حلقهي آروماتيک که با يک پل 3 کربنه به هم متصل شدند. در 5 گروه ميتوانند قرار گيرند. فلاونول، فلاونون، آنتوسيانين، فلاون، فلاون-3-ال و ايزو فلاون. فلاونها ومشتقات آنها (فلاونوئيدها) موادي هستند که بصورت آزاد در بسياري از گياهان و يا بصورت ترکيب با گليکوزيدها وجود دارند. عموما محلول در آب هستندو مهمترين مشتقات فلاونها به رنگ زرد مي باشند. فلاون ها در گياهان خانوادهي کاسني، پروانه آسا، سداب و برخي خانوادههاي ديگر يافت ميشوند [10و11].
1-1-3- کومارين‌ها
کومارين‌ها متعلق به خانواده گسترده‌اي از متابوليت‌هاي گياهي به نام بنزوپيرانون‌ها با بيش از 1500 ترکيب شاخص در بيش از 800 گونه گياهي است. اين مشتق‌هاي 1-بنزوپيراني، عمدتاً در گياهان عالي يافت مي‌شوند. بيشتر کومارين‌هاي طبيعي در موقعيت کربن7 اکسيژن‌دار هستند. در گياهان، اين ترکيبات در پوشش بذر، ريشه‌ها، برگ‌ها، ساقه و بيشتر در گل‌ها و ميوه يافت مي‌شوند. کومارين‌ها به عنوان ترکيبات دفاعي گياه، ضدميکروبي و مانع جوانه‌زني نيز شناخته مي‌شوند [12 و 13].
1-1-4- گليکوزيدها
گليکوزيدها در مسيرهاي مختلف متابوليکي به شکلهاي گوناگوني ساخته ميشوند.اين مواد داراي ساختمان شيميايي پيچيده و مخصوصي هستند و در بدن انسان اثرهاي خاصي نيز بر جاي ميگذارند.گليکوزيدها پس از هيدروليز به ترکيبات قندي (گليکون) و غير قندي (آگليکون) تبديل ميشوند. آگليکونها مصارف فراواني در داروسازي دارند. يکي از مهمترين ترکيبات گليکوزيدي، گليکوزيدهاي سيانوژنتيک هستند که از مهمترين آنها ميتوان آميگدالين را نام برد که بطور وسيعي در گياهان خانوادهي گل سرخ، پروانه آسا، کتان و برخي خانوادههاي ديگر وجود دارد. يکي ديگر از گليکوزيدهاي مهم آنتراکينونها هستند که نقش عمدهاي در درمان يبوست دارند. ازديگر گليکوزيدها ميتوان به گليکوزيدهاي قلبي ، ساپونيني، فلاونوئيدي، کوماريني و غيره نام برد [10].
1-1-5- ليگنان‌ها
ليگنان‌ها ترکيبات ديمري هستند که اساساً از اتحاد دو مولکول فنيل‌پروپان تشکيل مي‌شوند. زماني اين اعتقاد وجود داشت که ليگنان‌ها واسطه‌هاي پيش از تشکيل ليگنين هستند ولي امروزه مشخص شده است که اين ترکيبات انشعابي از مسير بيوسنتز ليگنين مي‌باشند. ليگنان‌ها برخلاف ليگنين ترکيباتي با فعاليت نوري هستند و احتمالاً طي يک واکنش مزدوج شدن احيايي از نوع فضاويژه بين کربن‌هاي مياني موجود در زنجيره جانبي مونومر به وجود مي‌آيند. از مهمترين مثال‌هاي دارويي، ترکيبات ليگناني موجود در گونه پودوفيلوم است که به نظر مي‌رسد از دو مولکول کونيفريل الکل يا اسيد مربوط ايجاد شده باشند [9].
1-1-6- استروئيدها
استروئيدها، گروهي از ترکيبات آلي هستند که از تري‌ترپن‌هاي چهار حلقه‌اي مشتق مي‌شوند و داراي ساختار کلي سيکلوپنتا پرهيدرو فنانترن مي‌باشند. معمولاً گروه‌هاي متيل در کربن‌هاي 10و13 وجود دارند و در کربن 17 زنجير جانبي الکيلي ممکن است وجود داشته باشد. تنوع در استروئيدها ناشي از تعداد گروه‌هاي متيل افزايشي، پيکربندي زنجير جانبي و گروه‌هاي عاملي متصل به حلقه‌هاست [13 و 14].
1-1-7- اسانس‌ها
اسانس‌ها، ترکيبات کم و بيش فرار با بوي ويژه هستند که با روش‌هاي تقطير با آب، بخارآب، آب ‌و بخارآب، تقطير خشک و غيره از گياه خام به استثناي مرکبات (استخراج اسانس با روش‌هاي مکانيکي) بدست مي‌آيند [16]. اين گروه از مواد مؤثر گياهي، از نظر ترکيب شيميايي همگن نيستند. بلکه به صورت مخلوطي از ترکيبات مختلف مي‌باشند. اسانس‌ها براساس مبدأ بيوسنتز و ساختار شيميايي قابل تقسيم‌بندي هستند.
1-1-7-1- شيمي اسانس‌ها
ترکيبات اسانسي ‌برمبناي ساختار شيميايي به صورت زير طبقه‌بندي مي‌شوند [15 و 17]. در شکل (1-1) نمونه ساختارهايي از ترکيبات اسانسي مذکور آورده شده است.
1- n-آلکان‌ها: تترادکان در اسانس گل‌نرگس
2- اسيدهاي آزاد: ترانس-سيناميک اسيد در اسانس دارچين
3- الکل‌هاي آزاد: ايزوآميل‌الکل در اسانس بابونه
4- آلدهيدي: بنزآلدهيد در اسانس بادام تلخ
5- کتوني: ليمونن در اسانس زيره
6- استري: متيل‌ساليسيلات در اسانس گياه هميشه‌سبز
7- فنيل پروپانوئيدي: آنتول در اسانس شويد
8- لاکتوني: سيکلوپنتا دکانوليد در اسانس ريشه گل‌پر
9- فتاليدي: سدانوليد در اسانس کرفس
10- هيدروکربن‌هاي نيتروژن‌دار: متيلN-متيل آنترانيلات در اسانس ماندارين
11- هيدروکربن‌دار گوگردي: 4-مرکاپتو-4-متيل-پنتانون در اسانس انگور فرنگي‌
سياه
12- هيدروکربن‌هاي گوگردي‌نيتروژن‌دار: آليل ايزوسيانات در اسانس خردل
13- اتري: سافرول در اسانس ساسافراس
14- فنلي: تيمول در اسانس آويشن
15- پراکسيدي: آسکاريدول در اسانس کنوپوديوم
16- ترپن‌ها: ترپن‌ها يا ايزوپرنوئيدها، از بزرگترين دسته‌ ترکيبات طبيعي هستند که از اتصال دو يا بيشتر مولکول ايزوپرن (C5 H8) ساخته مي شوند. ايزوپرن به عنوان همي‌ترپن‌ محسوب مي‌شود. مونوترپن‌ها از دو واحد ايزوپرن به هم‌چسبيده تشکيل مي‌شوند. سزکوئي‌ترپن‌ها شامل سه واحد ايزوپرن هستند. ترکيباتي که از چهار واحد ايزوپرن ساخته شده‌اند؛ دي‌ترپن ناميده مي‌شوند. در ادامه تقسيم‌بندي مفصل‌تري از ترپن‌ها ارائه مي‌شود.

شکل1-1: ساختار ترکيبات اسانسي
1-1-7-2- بيوسنتز اسانس‌ها
ترکيبات اسانسي براساس مبدأ بيوسنتز عمدتاً به دو دسته: ترپني و فنيل‌پروپانوئيدي تقسيم بندي مي شوند که از مسيرهاي بيوسنتزي ذيل منتج مي‌شوند:
مسيرهاي موالوناتي و غيرموالوناتي
ترپن‌ها از لحاظ زيست‌زادي از ايزوپرنيل‌دي‌فسفات (IPP)‌ و دي‌متيل‌آليل‌دي‌فسفات (DMAPP) به وجود مي‌آيند. اين دو قسمت ساده 5 کربنه به عنوان پيش‌سازهاي معمول براي بيوسنتز ترپن‌ها هستند. آنها از سه واحد استيل‌کوآنزيمA از طريق مسير موالونيک‌اسيد (MVA) بيوسنتز مي‌شوند. چندين سال پيش، وجود مسير دومي که منجر به IPP و DMAPP مي‌شود، شامل 1-دئوکسي-D-گزيلولوز-5-فسفات (DXP) و C2-متيل-D-اريتريتول-4-فسفات (MEP) کشف شد.اين مسير غير‌موالوناتي يا دئوکسي‌گزيلولوز با تراکم گليسرآلدهيدفسفات و پيروات شروع مي‌شود که به توليد DXP مي‌انجامد (شکل1-2). IPPو DMAPP به ژرانيل‌پيروفسفات (GPP) منجر مي‌شود که پيش‌ساز آغازي مونوترپن‌هاست. تشکيل نريل‌پيروفسفات (NPP) ازGPP طيف گسترده‌اي از ساختارهاي غيرحلقوي، حلقوي، دوحلقه‌اي يا سه‌حلقه‌اي را پديد مي‌آورد. واکنش‌هايي مثل نوآرايي، اکسايش، کاهش و آبدار شدن از طريق آنزيم سيکلاز ترپن‌هاي مختلف به تشکيل مشتقات ترپني متنوع منجر مي‌شود. تراکمGPP و IPP به تشکيل فارنسيل‌پيروفسفات (FPP) مي‌انجامد که پيش‌ساز آغازي سزکوئي‌ترپنوئيدهاست. همچنين FPP و IPP به تشکيل دي‌ترپنوئيدها منجر مي‌شوند. مسير غيرموالوناتي در بيشتر باکتري‌ها و همه موجودات زنده فتوتروپيک وجود دارد. در گياهان عالي و بيشتر جلبک‌ها، هر دو مسير بيوسنتز به‌طور مستقل عمل مي‌کند. مسير موالوناتي در سيتوپلاسم واقع شده و مسئول بيوسنتز بيشتر سزکوئي‌ترپنوئيدهاست. در مقابل، مسير غيرموالوناتي به کلروپلاست محدود مي‌شود و مونوترپن‌ها و دي‌ترپن‌ها از اين مسير بيوسنتز مي‌شوند [17].
شکل 1-2: مسيرهاي بيوسنتز پيش‌سازهاي ترپنوئيدها
مسير شيکميک‌اسيد
فنيل‌پروپانوئيدها از مسير شيکميک‌اسيد بيوسنتز مي‌شوند.اين مسير سبب توليد آمينو‌اسيد فنيل‌آلانين مي‌شوند و سپس بر اثر فعاليت آنزيم فنيل‌آلانين آمونيالياز (PAL) به ترانس-سيناميک‌اسيد تبديل مي‌شود. که با اثر فعاليت آنزيم‌هاي مختلف مثل هيدرولاز، اتيل‌ترانسفراز، اکسيدو رداکتاز و ليگاز طيف وسيعي از فنيل‌پروپانوئيدها بيوسنتز مي‌شوند (شکل1-3). فنيل‌پروپانوئيدها شامل يک يا بيشترC3-C6 است که واحد C6 حضور حلقه بنزن را نشان مي‌دهد. فنيل‌پروپانوئيدهاي ساده، از اجزاي اسانس‌هاي طبيعي هستند. روش طبقه‌بندي پذيرفته‌شده‌اي براي اين دسته از ترکيبات وجود ندارد. فنيل‌پروپانوئيدهاي مهم از اين قرارند: آنتول، متيل‌چاويکول، اوژنول، سيناميک‌آلدهيد و وانيلين [17].
شکل 1-3: مسير بيوسنتز شيکميک اسيد در فنيل‌پروپانوئيدها
1-1-7-3- کاربردهاي اسانس‌هاي طبيعي
امروزه اسانس‌هاي طبيعي داراي مصارف مختلفي در صنايع شيميايي، عطرسازي، غذايي، تهيه و ساخت فرآورده‌هاي آرايشي- بهداشتي و دارويي مي‌باشند و تحقيقات بيانگر فعاليت‌هاي ضدحشره، ضدميکروبي، ضد اکسيداني آنهاست.
مهمترين مصرف گياهان اسانس‌دار و مواد اسانسي حاصل از آنها براي معطرسازي مي‌باشد. در صنايع عطرسازي، اسانس‌ها جزء اصلي مواد اوليه عطرها محسوب مي‌شوند. مانند فنيل‌اتيل‌الکل که يکي از مواد اصلي عطرها بوده و در صنعت تهيه عطر مصنوعي استفاده مي‌شود.
از کاربرد اين مواد در صنايع غذايي مي‌توان به خوشبوکننده‌ها و طعم‌دهنده‌هاي محصولات غذايي اشاره کرد. انواع مختلف ادويه‌ها در اين دسته قرار مي‌گيرند. علاوه‌براين اسانس‌ها به عنوان ضد ‌اکسيدان در فرآورده‌هاي غذايي کاربرد دارند به‌طور مثال؛ اسانس‌هاي ميخک و آويشن حاوي اوژنول و تيمول در فرآورده‌هاي غذايي مثل کره به عنوان ضد اکسيدان مصرف مي‌شوند. تيمول اثر ضد هيدروليتيکي داشته و از هيدروليز آنزيمي جلوگيري مي‌کند. همچنين از اسانس‌ها در تهيه محصولات آرايشي- بهداشتي، دهان‌شويه‌ها، خميردندان و فرمولاسيون شامپوهاي طبي استفاده مي‌شود [15].
1-2- عصاره‌هاي گياهي
عصاره‌ها فراورده هايي هستند كه از گياهان با حلال هاي مناسب مانند الكل اتيليك، آب، اتيلن گليكول اتر وباروش هاي متفاوت به دست مي آيند. درصورتي كه كليه مواد موجود در گياه عصاره گيري شده و عصاره حاوي تمام تركيب هاي موجود در گياه باشد، عصاره تام ناميده مي شود ودر صورتي كه شرايط استخراج (نوع حلال، روش استخراج ودستگاه) به نحوي انتخاب شود كه قسمتي از موادگياه استخراج شود، عصاره داراي برخي خواص گياه مي‌باشد. هم چنين در صورتي كه گياه طي تجزيه به دو يا چند قسمت تقسيم شود و يا قسمتي از مواد مورد نظر آنها استخراج گردد، عصاره غيرتام مي نامند [18] .
1-2-1- استخراج عصاره گياهي
با توجه به اينکه منابع گياهي، مجموعه پيچده‌اي از متابوليت‌ها هستند؛ روش استخراج ايده‌ال بايد قابليت استخراج کامل متابوليت‌هاي گياهي را داشته و سريع، ساده و تکرارپذير باشد. انتخاب روش استخراج به ماهيت منبع گياهي و ترکيبات استخراجي بستگي دارد [7]. در اينجا به چند مورد از روش‌هاي مورد استفاده در جداسازي عصاره‌هاي گياهي اشاره مي‌شود:
1-خيساندن1
2-نفوذ-تراوش2
3-استخراج گرم‌ومداوم3
4-استخراج با حلال تحت فشار4
5-استخراج با حلال و امواج فراصوت5
6-استخراج با سيال فوق‌بحراني6
7-فرايند فيتونيک7
8-استخراج جريان مخالف8
ازآنجايي که در اين پژوهش از روش استخراج گرم ‌و مداوم (سوکسله) استفاده شده است؛ به توضيح آن مي‌پردازيم.
1-2-1-1- استخراج گرم ‌و مداوم (سوکسله)
اين روش در استخراج متابوليت‌هاي گياهي به علت راحتي آن به طور گسترده استفاده مي‌شود و در استخراج مقياس‌هاي کوچک و بزرگ کاربرد دارد. پودر گياهي در يک بسته سلولزي (کارتوش9) در محفظه استخراج قرار مي‌گيرد که بر روي فلاسک جمع‌آوري کننده حلال حاوي متابوليت واقع مي‌شود و خنک‌کننده در بالاي کارتوش قرارداده مي‌شود. و حلال مناسبي به فلاسک افزوده و حرارت زير آن تنظيم مي‌شود. وقتي که سطح معيني از حلال در تيمبل جمع مي‌شود؛ حلال به سمت محفظه پايين فلاسک مکيده مي‌شود (شکل1-4).
مزيت عمده اين روش، مداوم بودن فرايند استخراج است. ازآن‌جايي‌که حلال حاوي متابوليت به داخل فلاسک تخليه مي‌شود؛ حلال تازه بازتوليدي ناشي از مبرد، فرايند استخراج از مواد در کارتوش را به طور پيوسته ادامه مي‌دهد.
اين روش در مقياس با خيساندن و پرکولاسيون به زمان و حلال مصرفي کمتري نياز دارد. عيب عمده استخراج سوکسله اين است که عصاره به طور مستقيم در نقطه جوش حلال حرارت مي‌بيند که در اين حالت امکان آسيب به ترکيبات حساس به گرما وجود دارد و ممکن است؛ شروعي براي تشکيل متابوليت‌هاي مصنوعي باشد [19].
شکل1-4 : دستگاه سوکسله
1-2-2- استخراج اسانس‌هاي طبيعي
مواد معطر موجود در گياهان که بيشترين قسمت آن را اسانس‌ تشکيل مي‌دهد، مخلوطي از ترکيبات متنوع است که جداسازي و شناسايي اين مواد تلفيقي ازسه عنصر: هنر، شيمي و روش‌هاي تجزيه دستگاهي است. امروزه براي جداسازي ترکيبات اسانس‌هاي طبيعي از روش‌هاي مختلفي استفاده مي‌گردد که بر حسب عواملي نظير نوع گياه، محل قرارگيري اسانس در اندام‌هاي گياهي، نوع مواد و ترکيبات تشکيل دهنده و سرانجام درجه خلوص مواد نهايي روش مناسب انتخاب مي‌شود [15]. در اينجا، به روش‌هاي متنوع اسانس‌گيري اشاره مي‌شود [17،16 و 20].
روش‌هاي تقطير: تقطير با آب10، تقطير با آب‌وبخارآب11، تقطير با بخارمستقيم12، تقطير با امواج ميکرو ويو13، تقطيرواستخراج‌همزمان14
روش‌هاي فشاري: فشاري‌اسفنجي15، فشاري‌با پياله‌مخصوص16، فشاري‌ماشيني (اسفوماتريسي17، پلاتريسي18 و فرايند براون19)
روش‌هاي استخراج ‌با حلال: خواباندن در ميان چربي20، خيساندن، سيال‌فوق‌بحراني
روش‌هاي استخراج ‌با امواج ‌فراصوت، استخراج با امواج‌ميکرو ويو (MHG21، 22SFME)
روش‌هاي نمونه‌برداري و استخراج در مقياس ميکرو (SPME23، DHS24، 25SHS، VHS26، SBSE27)
ازآنجايي که براي استخراج ترکيبات فرار در اين پژوهش از روش SDE استفاده شده است؛ به توضيح آن مي‌پردازيم.
1-2-2-1- تقطير همزمان با استخراج حلال آلي (SDE)
يكي از روش‌هاي خاص براي جدا سازي مواد فرار از گياهان، موادغذايي و ديگر توليدات كشاورزي روش تقطير با بخار و حلال است . دراين روش استخراج به طور مكرر با آب وحلال آلي دنبال مي گردد. اين روش (دو گردش به طور همزمان) توسط نيکرسون28 و ليکنز29 (1964) طراحي ومورد تأييد قرار گرفته است (شکل1-5). مزيت اين روش به غلظت خيلي از تركيب هاي كم در حد ppb30 در مايعات بوده است كه با يك گردش دريك ساعت صورت گرفت و البته دراين آزمايش مقدار خيلي كمي از حلال به كاربرده شد.
ويليامز31 (1969) روش تجزيه مشابهي را با دستگاه پيچيده تري طراحي و ساخته است . دراين روش براي سرد كردن بخارسطح مبرد بيشتر از ديگر روش‌ها با بخار درتماس است البته حلال استخراجي در مرحله بعد جدا مي گردد . ماده در روش استخراج وتقطير به طور همزمان در مرحله مايع تغليظ شده و دائماً به بالن‌هاي مربوطه‌شان كه بين قسمت مشترك تشكيل دو مرحله در لوله جداكننده (مركز لوله پايين مبرد) وكمي پايين‌تراز قسمت زير مبرد ودرآخر بازو كه حلال برگشت مي شود؛ استخراج مي گردد [4].
امروزه با توسعه روش‌ها علاوه بر SDE در فشار اتمسفر، روش‌هاي ديگري مثل SDE در مقياس‌ميکرو، SDEدر مقياس تهيه‌اي و SDE در فشار کاهش‌يافته يا خلأ به کار گرفته شده است. از مزاياي استخراج ‌و تقطير همزمان؛ تک‌مرحله‌اي بودن، سرعت عمل، حجم حلال مصرفي کم به‌خاطر بازيافت مداوم و اسانس‌هاي عاري از ترکيبات غيرفرار مثل کلروفيل است و در روش SDEبا مقياس ‌ميکرو ضمن مصرف حلال کم، نيازي به غليظ‌سازي عصاره نيست که باعث کاهش هدررفت ترکيبات فرار مي‌شود [17،21 و 22].
شکل1-5: دستگاه تقطير و استخراج همزمان
1-3- تركيب‌هاي ضد اكسيدان
ضد اكسيدان‌ها موادي هستند كه در غلظت كم و با سازوكاري ويژه از عمل اكسايش جلوگيري مي كنند ويا باعث كاهش ويا به تأخير افتادن آن مي شوند [23] .
سال‌هاي سال است که به منظور جلوگيري از تخريب مواد غذايي که به دليل اکسايش چربي‌هاي غيراشباع و ساير عوامل روي مي‌دهد، ضد ‌اکسيدان‌ها را به فراورده‌هاي غذايي مي‌افزايند. به هر حال بسياري از ضد ‌اکسيدان‌هاي مصنوعي که طي 50 سال اخير مورد استفاده بوده‌اند، براي مصرف‌کنندگان امروزي که به دنبال مواد غذايي هرچه طبيعي‌تر مي‌گردند، ديگر قابل‌قبول نيستند. اين امر باعث جستجو براي يافتن ضد ‌اکسيدان‌هاي طبيعي شد که جزء اصلي سازنده‌شان مواد فنلي مي‌باشد [5].
ويژگي‌هاي اكسيدكنندگي اكسيژن نقش حياتي در اعمال بيولوژيكي متفاوت مثل استفاده از غذا، انتقال الكترون براي توليد ATPدارد، در حالي كه اكسيژن براي حيات ضروري است، همچنين مي‌تواند باعث اكسيد كردن مواد درون سلول شود و نقش تخريب كننده داشته باشد. اكسيژن مي‌تواند به اشكال بسيار فعال مثل راديكال‌هاي سوپراكسيد، راديكال‌هاي هيدروكسيل و هيدروژن پراكسيد تبديل شود و به اين صورت مي‌تواند به DNA آسيب برساند، يا اينكه آنزيم‌هاي ضروري و پروتئين‌هاي ساختاري را تخريب كند. همچنين مي‌تواند واكنش‌هاي زنجيره‌اي از كنترل خارج شده مثل واكنش‌هاي اکسايش خود به خودي و پراكسيداسيون را برانگيزد.
پلي فنل‌ها انواعي از ضد ‌اكسيدان‌ها هستند كه در جلوگيري از بسياري بيماري‌ها از جمله سرطان نقش دارند، اين تركيبات بسيار متنوع هستند واثرات متفاوتي دارند. تركيبات فنلي شامل ويتامين‌ها، رنگدانه‌ها و فلاونوئيدها، ويژگي‌هاي ضدجهشي ودر نتيجه ضد سرطاني و همچنين فعاليت كاهش قند خون را برعهده دارند [24].
1-3-1- روش هاي سنجش فعاليت ضد ‌اكسيداني
اين روش‌ها بر دو اصل استوار است كه عبارتند از:
الف) روش هايي كه مبناي آن‌ها انتقال اتم هيدروژن است .
اين سنجش‌ها براساس توانايي ماده ضد اكسيدان براي رقابت با ماده شيميايي مستعد اكسايش (جز مورد عمل) درانتقال اتم هيدروژن به راديكال هاي آزاد ارزيابي مي شود . دراين روش اغلب از يك توليد كننده راديكال كه راديكال هاي پايدار با طول عمر كوتاه توليد مي‌كند؛ استفاده مي شود همچنين علاوه بر ضد اكسيدان، مولكول قابل اكسايش نيز استفاده مي‌شود . ضد اكسيدان هاي اضافه شده با جز مورد عمل براي گرفتن راديكال آزاد رقابت مي‌كنند. از آن جايي كه در بررسي ظرفيت ضد اكسيداني عصاره از آزمايش مهار اكسايش لينولئيك اسيد استفاده شد [25] . دراين جا به شرح اين روش پرداخته مي شود.
1-3-1-1- آزمون بي‌رنگ شدن بتا كاروتن در حضور لينولئيك اسيد32
دراين روش لينولئيك اسيد در محيط آبي اشباع از اكسيژن مولكولي (O2) اكسيد شده وبه راديكال آزاد مربوطه LOO. تبديل مي شود. اين راديكال آزاد در مرحله بعد با جذب هيدروژن اتمي (H· ) ازبتاكاروتن موجب اكسيد شدن آن و زايل شدن رنگ زرد نارنجي ناشي ازآن مي شود . وجود ماده ضد اكسيدان در محيط مي تواند با بتاكاروتن در دادن هيدروژن اتمي رقابت نموده واز زايل شدن رنگ جلوگيري نمايد . اين آزمايش نمونه اي از سنجش به روش انتقال اتم هيدروژن است ودرآن ميزان زوال رنگ بتا كاروتن با سنجش ميزان جذب نور آن در طول موج 470 نانومتر معين مي شود [26و27] .
ب) روش‌هايي كه مبناي آن‌ها انتقال الكترون است.
1-3-1-2- سنجش مقدار تام فنل با FCR33
اين روش ابتدا براي پروتئين‌ها به كار رفت واساس آن تمايل به باقي مانده تيروزين است (آمينو اسيد تيروزين داراي يك گروه فنلي است.) چند سال بعد سينگلتون34 وهمكارانش اين روش را براي آناليز مقدار تام فنل در شراب به كار بردند و به تدريج اين روش كاربرد زيادي پيدا كرد.
معرف فولين سيوكالتيو از جوشيدن مخلوط سديم تنگستات (Na2WO4.2H2O) ، سديم موليبدات (Na2MnO4.2H2O)، اسيد كلريدريك غليظ و اسيد فسفريك 85% به همراه افزودن آب تهيه مي شود و سپس ليتيم سولفات (li2SO4.4H2O) به مخلوط اضافه مي شود تا مخلوط زردرنگ كه همان معرف است؛ تهيه شود. وجود احيا كننده در محيط باعث ايجاد رنگ سبز رنگ و اضافه كردن اكسيد كننده مثل برومين رنگ زرد را حفظ مي كند . طبيعت شيميايي دقيق واكنشگر FC ناشناخته است . عقيده بر اين است كه حاوي هتروپلي فسفو تنگستات35 است. در اثر واكنش هاي برگشت پذير كاهش، گونه‌هاي آبي رنگي به وجود مي آيد كه احتمال مي رود به دليل تشكيل 4- (PMoW11O40 ] [ باشد. دراين روش اعتقاد براين است كه موليبدينيوم به آساني در مخلوط احيا مي شود و واكنش انتقال الكترون بين احيا كننده و موليبدينيوم اتفاق مي‌افتد.
Mo (VI)yellow+e (Mo (V)green
معرف فولين- سيوكالتيو يك معرف غير اختصاصي است و خيلي از تركيب هاي غيرفنلي را هم احيا مي كند كه از معايب آن به شمار مي رود. براي شناسايي تركيب هاي فنلي محيط را با محلول سديم كربنات تا PH حدود 10 قليايي مي‌كنند؛ در ضمن واكنش پروتون فنلي تبديل به آنيون فنلات مي شود كه اين آنيون قادر است معرف فولين – سيو كالتيو را احيا كند وآن را به رنگ سبز درآورد. سپس به روش رنگ سنجي مقدار تام فنل سنجيده مي شود. تركيبات آبي رنگي كه بين فنلات و واكنشگر FC تشكيل مي شود؛ مستقل از ساختار تركيب هاي فنلي است وكمپلكس بين تركيب هاي فنلي وفلز مركزي تشكيل مي شود [29-28].
1-3-1-3- سنجش ظرفيت به دام انداختن راديكال DPPH 36
روش ساده، سريع و ارزان براي اندازه‌گيري فعاليت ضد ‌اکسيداني که شامل استفاده از راديکال 2، 2-دي‌فنيل -1-پيکريل‌هيدازيل (DPPH) است. اين راديكال آزاد وپايدار است كه مي تواند يك الكترون و يا راديكال هيدروژن قبول كند وبه يك مولكول خنثي و پايدار تبديل شود . اين ماده به دليل دارا بودن الكترون منفرد داراي جذب قوي در طول موج 517 نانومتر مي باشد كه دراين مرحله، محلول متانولي آن بنفش رنگ است . در حضور ضد ‌اكسيدان با استفاده از اين تغيير جذب مي توان توانايي مولكول هاي مختلف را به عنوان مهار كننده راديكال آزاد سنجيد؛ درواقع ميزان تغيير در جذب هرنمونه به قدرت و توانايي جاذب راديكال بستگي دارد . احيا شدن DPPH و كاهش جذب در طول موج 517 نانومتر در دماي اتاق و پس از گذشت 5 دقيقه از شروع واكنش صورت مي گيرد . مزيت کاربرد DPPH اين است كه در زمان كوتاهي مي توان تعداد زيادي نمونه را اندازه گيري نمود و همچنين از حساسيت كافي برخوردار است.
نمودار صفحهي بعد احيا شدن DPPH را با يك نمونه ضد اكسيدان نشان مي‌دهد:
نمودار 1-1 : نمودار جذب- طول‌موج براي DPPH در حضور ضد اکسيدان
جذب راديكال DPPH در طول موج 517 نانومتر از قانون بير- لامبرت تبعيت مي كند و كاهش ميزان جذب آن با ميزان ماده ضد اكسيدان رابطه خطي دارد. به عبارتي در ازاي افزايش هرچه بيشتر ماده ضد اكسيداني، DPPH بيشتري مصرف مي شود و رنگ آن از بنفش به زرد مي گرايد. غلظتي از ضد اكسيدان كه باعث كاهش 50% از غلظت DPPH ابتدايي مي‌شود با 37IC50 تعريف مي شود . ميزان IC50 وخاصيت ضد اكسيداني با يكديگر نسبت عكس دارند؛ به صورتي كه هرچه ميزان IC50 كمتر باشد خاصيت ضد اكسيداني نمونه بيشتر است . اين روش نقاط ضعفي هم دارد . گزارش‌ها نشان مي دهد كه واكنش DPPH با اوژنول برگشت پذير است بنابراين براي نمونه هاي حاوي اوژنول وديگر فنل‌ها با ساختاري مشابه با اوژنول ظرفيت ضد اكسيداني را پايين‌تر از آنچه هست؛ نشان مي دهد [27 ،30 و 31].
1-4- کروماتوگرافي‌گازي38
از متداول ترين روش ها براي آناليز ترکيبات فرار گياهي، استفاده از کروماتوگرافي گازي (GC) است. در اين کروماتوگرافي‌ نمونه تبخير و به سر ستون کروماتوگرافي ترزيق مي‌شود. شويش با جرياني از فاز متحرک گازي بي‌اثر انجام مي‌شود. برعکس اکثر انواع ديگر کروماتوگرافي، فاز متحرک با مولکول‌هاي آناليت برهم‌کنش ندارد و فقط به عنوان وسيله‌اي براي گذار مولکول‌ها از داخل ستون عمل مي‌کند. کروماتوگرافي گاز- مايع کاربرد گسترده‌اي در تمام رشته‌هاي علوم دارد و معمولاً با نام مختصر کروماتوگرافي گازي ناميده مي‌شود. اين کروماتوگرافي بر پايه تقسيم آناليت بين يک فاز متحرک گازي و يک فاز تثبيت شده بر سطح يک جامد بي‌اثر بنا شده است.
1-4-1- اجزاي اصلي دستگاه کروماتوگرافي گازي
1-4-1-1- مخزن گاز حامل
گازهاي حامل که بايد از نظر شيميايي بي‌اثر باشند، عبارتند از هليم، نيتروژن، و هيدروژن. انتخاب گاز معمولاً با توجه به آشکارساز به کار رفته انجام مي‌شود. به همراه مخزن گاز، شيرهاي تنظيم فشار، اندازه‌نماها و‌جريان‌سنج‌‌ها در دسترس قرار مي‌گيرند.
1-4-1-2- سيستم تزريق نمونه
کارايي ستون به اين نياز دارد که اندازه نمونه مناسب باشد و به صورت توپي از بخار وارد شود؛ تزريق آهسته مقدار زياد نمونه سبب پهن شدن نوار و کاهش تفکيک مي‌شود. متداول‌ترين روش تزريق نمونه، استفاده از يک ريزسرنگ براي تزريق نمونه‌هاي مايع يا گازي از طريق يک درپوش غشايي خودبند يا ديافراگم لاستيکي سيليکوني به درون دريچه تبخيرکننده آني نمونه است که در سر ستون قرار دارد.
1-4-1-3- ستون ‌وآون‌ستون
در کروماتوگرافي گاز-مايع دو نوع ستون داريم؛ لوله‌پرشده و لوله‌باز يا مويين. طول ستون‌هاي کروماتوگرافي از کمتر از 2 متر تا50 متر يا بيشتر تغيير مي‌کند. ستون‌ها از فولاد زنگ‌نزن، شيشه، سيليس ‌جوش‌نخورده يا تفلون ساخته مي‌شوند. براي جا دادن ستون‌ها در داخل آون‌هاي دماپاي، معمولاً به شکل حلقه‌هاي با قطر 10تا30 سانتي‌متر ساخته مي‌شوند.
دماي ستون متغيري مهم است که بايد تا چند دهم درجه براي انجام کارهاي دقيق کنترل شود و بنابراين ستون معمولاً در يک آون دماپا جا داده مي‌شود. بهترين دما براي ستون به نقطه جوش نمونه و درجه جداسازي مورد نياز بستگي دارد.تقريباً دماي معادل يا کمي بالاتر از متوسط نقطه جوش نمونه، به يک زمان شويش مناسب منجر مي‌شود. براي نمونه‌هاي با گستره وسيع نقطه جوش، برنامه‌ريزي دما به کار گرفته مي‌شود که در آن دماي ستون به طور پيوسته و يا مرحله‌اي افزايش مي‌يابد، همچنان‌که جداسازي انجام مي‌شود.
1-4-1-4- سامانه آشکارساز


پاسخ دهید