4-13- برش محصول PCR اپرون ريبوزومي (ناحيه P1/P7) با بکار گيري آنزيم برشي Hinf I ………………………………..42
4-14- برش کامپيوتري اپرون ار. ان. اي ريبوزومي (ناحيه P1/P7) با بکار گيري آنزيم برشي Taq I …………………………..43
4-15- برش کامپيوتري اپرون ار. ان. اي ريبوزومي (ناحيه P1/P7) با بکار گيري آنزيم برشيHpa II …………………………44
4-16- دندروگرام حاصل از مقايسه تنوع نوکلئوتيدي اپرون ريبوزومي (ناحيه P1/P7) ……………………………………………….47
4-17- دندروگرام حاصل از مقايسه تنوع نوکلئوتيدي ژن ريبوزومي S16ُ……………………………………………………………………49
4-18- دندروگرام حاصل از مقايسه تنوع نوکلئوتيدي ناحيه ژنومي SR …………………………………………………………………….51
چکيده
تعيين ترادف اپرون ار. ان. اي ريبوزومي و آناليز فيلوژنتيکي فيتوپلاسماهاي همراه با بيماري تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر
توسط:
هادي محمودي پور
پيشتر بيماري تورم جوانه بادنجان و گوجه فرنگي به عنوان يک بيماري شايع و خسارتزا از استان بوشهر گزارش شده است. تحقيق مذکور بوته هاي آلوده بادنجان و توتون استان بوشهر متعلق به مناطق بنداروز، برازجان، بوشهر و کنگان را پس از انتقال به آزمايشگاه مرکز تحقيقات کشاورزي و منبع طبيعي فارس-زرقان مورد بررسي و مطالعه قرار داده و ذکر نموده است که جدايه هاي مورد مطالعه بر اساس علائم ايجاد شده در گياه پروانش به سه گروه تقسيم مي شوند. RFLP ژن ريبوزومي 16S نيز نتايج داده هاي بيولوژيک را تاييد کرده است. پيرو تحقيق مذکور، در اين تحقيق تعداد شش جدايه شامل پنج جدايه از بادنجان و يک جدايه توتون موجود بر روي گياه پروانش انتخاب و دي.ان.اي استخراج شده از بافتهاي گياهي (نمونه هاي برگ پروانش) طبق روش پيشنهادي مايکسنر و همکاران (1995) در آزمايش هاي بعدي مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمون PCR با بکارگيري جفت آغازگر P1/P7 ناحيه اپرون ار. ان. اي ريبوزومي جدايه هاي مذکور تکثير گرديد. هضم محصول PCR با آنزيم هاي Rsa I و Hinf I جدايه هاي مورد مورد تحقيق را به 3 گرو تقسيم کرد (جداي هاي 1،4 و 5 در يک گروه، جدايه 2 در يک گروه و جدايه 3 و 6 در گروه ديگر)، آنزيم Hae III جدايه ها را به دو گروه تقسيم کرد (1، 2، 4 و 5 در يک گروه و جدايه هاي 3 و6 در گروه ديگر) ولي آنزيم Alu I نتوانست مابين جدايه ها تمايز حاصل کند. قطعههاي تکثير شده در آزمون PCR با استفاده ازIns T/A clone PCR Product Cloning Kit (MBI Fermentas) در پلاسميد PTZ57R/T وارد و در سويه DH5? باکتري Escherichia coli همسانه سازي گرديد. آناليز ترادف نوکلئوتيدي نتايج آزمون RFLP را تاييد و جدايه ها را در سه گروه قرار داد. لازم به ذکر است آناليز فيلوژنتيک ناحيه اپرون ريبوزومي گروه يک را به دو زير گروه تقسيم کرد بطوري که جدايه 1، 4 را در يک زير گروه و جدايه 5 در زيرگروه ديگر قرار گرفت. علاوه بر اين جدايه هاي گروه 2 (جدايه هاي 3 و 6) نيز هر کدام در يک زير گروه قرار گرفتند. البته جدايه 3 با داشتن يک جايگاه برشي اضاف تر در موقعيت 938 با آنزيم برشي Hpa II مي تواند از جدايه 6 متمايز گردد.
فصـل اول
مقدمـه
1-1- مقدمه
براساس خوشبينانه ترين برآوردها، جمعيت جهان در پايان نيمه اول قرن بيست و يکم از مرز ده ميليارد نفر خواهد گذشت. اين در حالي است که بانک جهاني در سال 1994 اعلام کرده حدود هشتاد و سه درصد از اين جمعيت مربوط به کشور هاي در حال توسعه مي باشد. بدون شک مهمترين و حياتي ترين نياز اين جمعيت عظيم غذا و امنيت غذايي ميباشد. مطمئنا از طريق افزايش بهره وري، استفاده مناسب از وسايل و منبع توليد از جمله آب، خاک، نيروي انساني آموزش ديده و… ميتوان به توليد پايدار دست يافت و در نهايت بخشي از امنيت غذايي تامين کرد. در اين مبحث حفاظت از گياهان، کنترل آفات، بيماريها و علف هاي هرز حائز اهميت فوق العاده ميباشد. بعنوان مثال برابر تخمين وزارت کشاورزي آمريکا بيماريهاي گياهي سالانه 9.1، آفات 7.7 و علف هاي هرز 6.2 ميليارد دلار فقط در ايالات متحده خسارت وارد ميکنند. خسارت گياهي ناشي از آفات و بيماري ها نه تنها در عرضه مواد غذايي در سطح ملي و بين المللي تاثير دارد بلکه بر زندگي زارعي که گياه را براي مصرف مستقيم خود يا حتي براي فروش کاشته است نيز تاثير خواهد گذاشت.
رده ماليکيوتها گروهي از پروکاريوتهاي فاقد ديواره سلولي بوده که از نظر تکاملي از باکتريهاي گرم مثبتي که درصد مجموع سيتوزين و گوانين پايين دارند مشتق شده اند. بعضا اين گروه توانايي بيماريزايي در گياهان را دارند. از بيمارگرهاي گياهي واقع در اين گروه مي توان به اسپيروپلاسماها (داراي سلول هاي مارپيچ، متحرک و قابل کشت) و فيتوپلاسماها (سلول هاي غير مارپيچ و غير قابل کشت) اشاره کرد (Weisburg et al. 1989). از زمان کشف فيتوپلاسماها در سال 1967 ميلادي تا کنون بيش از صد ها بيماري همراه با فيتوپلاسما در بيش از 300 جنس گياهي شناخته شده است (Lee et al., 2000, McCoy et al., 1979 and Seemuller et al., 1998).
فيتوپلاسماها با نام قبلي شبه مايکوپلاسما(MLO) (IRPCM, 2004) محدود به آوند هاي آبکشي گياهان ميزبان و همچنين همولنف حشره ناقل ميباشند (Lee et al., 2000). اين گروه از بيمارگرهاي گياهي در طبيعت توسط ناقلين مکنده که عمدتا زنجرکهاي برگي(Leafhopper) بوده و متعلق به خانواده Cicadellidae ميباشند (Lee et al., 2000) با روش پايا و تکثيري (Firrao et al., 2005) گسترش پيدا ميکنند. البته در مواردي پسيل ها نيز بعنوان ناقل اينها گزارش شده اند (Lee et al., 2000). بيماري هاي فيتوپلاسمايي اغلب باعث عقيمي و مرگ گياه ميزبان شده و معمولا داراي خسارتي کم و بيش معادل صد در صد مي باشند که اين خسارت شامل کاهش کيفيت و کميت محصول ميباشد.
در ايران تاکنون پيرامون بيماري هاي فيتوپلاسمايي تحقيقات گستردهاي انجام شده است (صالحي و همکاران 1385). يکي از بيماري هاي مهم فيتوپلاسمايي در ايران بيماري تورم جوانه در بادنجان، گوجه فرنگي و توتون مي باشد (صالحي و ايزدپناه 1377، صالحي و همکاران 1379 و رئوفي و همکاران 1389). علائم در اين بيماري شامل: گل سبزي، برگ ساني، تورم جوانه، عقيم شدن، کاهش تعداد و اندازه گل، ازدياد جوانه هاي جانبي ساقه، جاروئي شدن انتهاي ساقه، طويل شدن غير معمول ميانگره، ريز برگي، تغيير رنگ برگها و جوانه ها، پيچيدگي و قاشقي شده برگها، سرخشکيدگي، زوال و مرگ گياه ميباشد (Lee et al., 2000).
حدود 483 هزار هکتار از اراضي کشور سالانه (سال زراعي 85-1384) به گروه سبزي جات اختصاص داشته است. حدود نيمي از اين مقدار در 7 استان خوزستان، فارس، کرمان، اصفهان، هرمزگان، آذربايجان شرقي و همدان کشت شده است. استان بوشهر در اين سال با کشت حدود 75/3 درصد سبزيجات مقام 13 را به خود اختصاص داده است. از 17 هزار هکتار سطح زير کشت در اين استان حدود 14 هزار هکتار به محصول گوجه فرنگي و حدود 2 هزار هکتار به ساير سبزي جات از جمله بادنجان، فلفل و… اختصاص داشته است. علاوه بر موارد ذکر شده، استان بوشهر مقام اول توليد گوجه فرنگي خارج از فصل را در کشور به خود اختصاص داده است (آمارنامه کشاورزي 1384).
بيماري تورم جوانه در گياهان بادنجان، گوجه فرنگي و توتون يکي از مهمترين بيماري هاي
سيفي جات مي باشد (Shew and lucas1991). بيماري تورم جوانه پيشتر از مزارع ورامين-اطراف کرج (اسکندري و همکاران 1349) فارس (صالحي و همکاران 1374) استانهاي اردبيل اصفهان و آذربايجان غربي (رشيدي و همکاران 1385) و خراسان (جمشيدي و همکاران 1389) گزارش شده است. اين بيماري داراي خسارات عمده و چشمگيري در استان بوشهر و بويژه مناطق برازجان، کنگان و بنداروز ميباشد (رئوفي و همکاران 1389). بررسيهاي سالهاي 1387 و1388 نشان داد که اين بيماري در اکثر مزارع بادنجان استان بوشهر وجود دارد. با توجه به علائم ناشي از مايه زني عامل بيماري تورم جوانه بادنجان به گياه پروانش و مقايسه چند شکل طولي قطعات برشي محصول واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR-RFLP) نشان داد که فيتوپلاسماهاي عامل تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر متنوع است و حداقل به سه گروه تقسيم ميشوند. (رئوفي و همکاران 1389).
با توجه به اهميت بيماري و اينکه ماهيت فيتوپلاسمايي عامل بيماري بويژه از نظر گروهبندي و شباهت و يا تفاوت با فبتوپلاسماهاي ديگر در ايران و دنيا مشخص نشده بود، در تحقيق حاضر مطالعات زير انجام گرديد.
1- انتقال همزمان عامل جدايه هاي مختلف بيماري تورم جوانه به پروانش هاي همسن و مقايسه علائم بيماري در آنها

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2- تکثير يک قطعه 1800 جفت بازي از اپرون ار. ان. اي ريبوزومي در آزمون PCR با جفت آغازگر P1/P7
3- RFLP فيزيکي محصول PCR با آنزيم هاي Alu I، Hinf I، Hae III و Rsa I
4- همسانه سازي و تعيين ترادف محصول PCR
5- انجام آناليز هاي مختلف مولکولي شامل جستجو با برنامه بلاست، بررسي ميزان همولوژي، ترسيم درخت فيلوژنتيکي، RFLP کامپيوتري و در نهايت تعيين موقعيت فيتوپلاسما (فبتوپلاسماهاي) عامل تورم جوانه در بين فيتوپلاسماها از نظر گروه هاي اصلي و زيرگروه ها
فصـل دوم
مـروري بر پژوهش هـاي پيشين
2-1-بادنجان
2-1-1-تاريخچه بادنجان
اين گياه بومي آسيا بوده و احتمالا در مناطقي از هندوستان و يا چين کشت ميشده است. در هندوستان کشت اين گياه داراي قدمت تاريخي بالايي ميباشد. و طبق مدارک موجود در قرن پنجم کشت اين گياه در چين مرسوم بوده ولي اروپا قدمت چنداني در کشت اين محصول ندارد (Singh et al., 1997 and Splittstosser 1990). بهنظر مي رسد که مسلمانان در گسترش اين گياه به اروپا نقش عمده و موثري داشته اند (مبلي و پيراسته 1373).
2-1-2- مشخصات گياه شناسي
گياهي يکساله متعلق به نهاندانگان دولپه بوده ولي بسته به شرايط آب و هوايي مي تواند بيش از يک سال نيز دوام بياورد (Halfaere and Barden 1979). اين گياه متعلق به تيرهSolanaceae و با نام علمي Solanum melogenaمي باشد. ساقه اين گياه قوي، خشن و چوبي بوده و ارتفاع آن ميتواند به 60 سانتي متر تا يک متر برسد. برگ هاي پهن و کشيده آن بصورت متناوب روي ساقه قرار ميگيرد و ممکن است با کرک پوشيده شده باشد. ميوه اين گياه قلمي يا کشيده با رنگهاي ارغواني، سياه، بنفش، بنفش مايل به سياه و يا سفيد است. بهترين دما جهت رشد بادنجان 32-26 درجه سانتي گراد در روز و 26-21 درجه در شب مي باشد (Halfare and Baren 1979). اين گياه نسبت به گوجه فرنگي حساسيت بيشتري به سرما دارد (Ware and McCollum 1980).
2-1-3-ارقام بادنجان:
2-1-3-1- بادنجان پاکوتاه (Dwarf eggplant):
نام علمي اين واريته Solanum melonena Var. depressumميباشد. ميوه بسيار کوچک، بنفش رنگ و گلابي شکل است. طول دوره رشد کوتاه مي باشد (شيباني 1367).
2-1-3-2-بادنجان قلمي (Snake eggplant):
نام علمي اين واريته Solanum melogena Var. serpentinum ميباشد. ميوه در اين نوع بسيار دراز و باريک به طول 30-25 سانتي متر و قطري در حدود 4-3 سانتي متر ميباشد (شيباني 1367).
2-1-3-3-بادنجان معمولي (Common eggplant):
نام علمي اين واريته Solanum melogena Var. esculentumميباشد. ارتفاع بوته در اين بادنجان تا 120 سانتي متر نيز ميرسد. طول ميوه 4-3 برابر قطر آن ميباشد (شيباني 1367).
2-2-گوجه فرنگي
2-2-1-تاريخچه
يکي از مهمترين سبزيهاي دنياست. ممکن است بومي آمريکاي مرکزي باشد (Halfaere and Barden 1979) ولي برخي منابع موطن آنرا آمريکاي جنوبي مي دانند (قادري 1353، Halfare and Barden 1979). نام گوجه فرنگي (Tomato) گرفته شده از يک کلمه مکزيکي بنام Tomati ميباشد (Rodale et al., 1977). در ابتدا گوجه فرنگي را يک گياه زينتي محسوب ميکردند (Nonnecke 1989) و ميوه آنرا سمي ميدانستند (Everett 1984). در سال 1956 اين گياه به اروپا انتقال داده شده است (Everett 1984).
2-2-2-مشخصات گياه شناسي
نام علمي اين گياه Lycopersicum esculentum بوده و به تيره Solanaceae تعلق دارد. اين گياه مي تواند در مناطق سردسير بصورت گياهي يک ساله و يا در مناطق گرمسير بصورت گياهي چند ساله مطرح باشد (Janick 1989 and Gollan 1992). برگها مرکب و ساقه جوان آن پوشيده از کرک هاي ريز و سفيد ميباشد. ساقه در هنگام جواني گياه سبز، کرک دار، گرد و خيلي شکننده است. برگ هاي مرکب بصورت متناوب روي ساقه قرار دارند. گل در اين گياه کامل (Perfect flower) و هر خوشه بين 8-4 گل دارد (Halfaere and Barden 1979). اين گياه به طول دوره روشنايي در روز حساس نبوده ( Nonnecke 1989) ولي چنانچه ميزان روشنايي کمتر از 5 ساعت باشد يا اينکه در معرض روشنايي دائم باشد ميوه نميدهد (Splittstoesser 1990). بهترين دما جهت رشد ونمو اين گياه 29-19 درجه
سانتيگراد ميباشد (Ware and Mccollun 1959) و در دماي بالاي 35 درجه رشدش متوقف و ميوه تشکيل نميشود (Ware and Mccollum 1980) در دماي پايين تر از 15 درجه امکان تلقيح براي گلها وجود ندارد (Nonnecke 1989).
2-2-3-ارقام گوجه فرنگي
اين گياه داراي ارقام متفاوتي ميباشد. برخي آنرا براساس زود ، ميان و يا دير رسي تقسيم بندي ميکنند. عده اي بر اساس طول بوته و البته در مواردي خصوصياتي از جمله مقاومت نسبت به ترکيدگي، همزمان رسيدن ميوه ها، مقاوم بودن نسبت به بيماريها و… جهت طبقه بندي ارقام مورد استفاده قرار ميگيرد. برخي ارقام آن عبارتند از (شيباني 1367، قادري 1353):
گوجه فرنگي معمولي (Lycopersicum esculentum Var. common)، برگ پهن (Lycopersicum esculentrum Var. grandifolium)، ريز آلبالويي شکل (Lycopersicum esculentum Var. cerasiforme)، گلابي شکل (Lycopersicum esculentum Var. pyriform) و با ساقه محکم و ايستاده (Lycopersicum esculentum Var. validum).
2-3- پروکاريوت هاي سخت کشت آوندي
اين گروه از باکتري ها بطور مستقيم بوسيله حشره تغذيه کننده از آوند ها به درون آوند هاي چوبي يا آبکشي وارد مي شوند و برخلاف ديگر باکتري ها به فضاهاي بين سلولي وارد نميشوند. اين باکتري ها را مي توان بطور کلي به 3 گروه زير تقسيم نمود.
1-باکتريهاي بدون ديواره سلولي(ماليکيوت) ساکن آوندهاي آبکشي شامل فيتوپلاسماها و اسپيروپلاسماها.
2- باکتري هاي ديواره دار و ساکن آوند هاي آبکشي: اين باکتريها عموماً کوچک وميلهاي شکل با ويژگي باکتري هاي گرم منفي مي باشند. ديواره خارجي در اين باکتريها حالت مواج دارد و به دليل اين خصوصيت قبلا آنها را تحت عنوان (Rickettsia-like organism (RLO مي شناختند (Fletcher and Wayadande 2002). تعداد 24 بيماري از گياهان تک لپه اي و دو لپه اي شامل گياهان علفي و درختي، سبزي ها، ميوه ها و غلات و گياهان زينتي ناشي از اين ميکروارگانيزم ها گزارش شده اند (Davis 2001). تعداد کمي از باکتري هاي ديواره دار ساکن آوند هاي آبکشي موقعيت تاکسونوميکي مشخص دارند و در رده Proteobacteriaقرار مي گيرند. Candidatus Liberibacter asiaticus وCa. L. africanus به ترتيب عامل بيماري ميوه سبز مرکبات در آسيا و آفريقا مي باشند که متعلق به اين گروه مي باشد. اخيرا اين باکتري در محيط کشت جدا سازي گرديده است (Sechler et al. 2009). باکتري عامل بيماري زردي حاشيه برگ هاي توت فرنگي با نام علميCa. Phlomobacter fragaria نيز در اين گروه قرار مي گيرد. تعيين موقعيت تاکسونوميک اين گروه از باکتريها از طريق تکثير برخي از نواحي ژنومي از جمله ژن 16S rRNA انجام مي گيرد (Fletcher and Wayadande 2002).
3- باکتري هاي سخت کشت ساکن آوندهاي چوبي:
برخي از باکتري هاي بيماريزاي ديوارهدار ساکن آوندهاي چوبي ميزبان خود ميباشند و برخي از آنها بوسيله زنجرکهاي سر مخروطي (sharpshooters) و سنها (spittle bugs) انتقال پيدا ميکنند ولي همه آنها ناقل حشرهاي ندارند مانند Leifsonia xyli subsp. xyli (Raju and Wells 1986). اين گروه از باکتري ها بدليل اينکه به سختي در محيط کشت رشد مي کنند سخت کشت (Fastidious) و بدليل اينکه اينکه ديواره موج دار دارند ريکتسيا مانندrickettsia) like ) ناميده مي شوند. با وجود اين تعدادي از اين باکتري ها قابل کشت ميباشند. دامنه ميزباني در اينها گسترده است و ايجاد بيماري هاي متنوعي مي کنند. يکي از اعضاي اين گروه، بيمارگر Xylella fastdiosa مي باشد که داراي دامنه ميزباني وسيع بوده و در اغلب آنها از نظر اقتصادي مهم مي باشد. بيماري پيرس انگور، فونيهلو، سوختگي برگ خرزهره، سوختگي برگ بادام و چندين درخت جنگلي از جمله بيماري هايي مي باشد که توسط اين بيمارگر ايجاد مي شوند (.(Fletcher and Wayadande 2002 اين باکتري X. fastidiosa) ( گرم منفي و ميله اي شکل با رشد کند در محيط هاي خاص مي باشد (Hopkins 2001).
عامل کوتولگي نيشکر (Leifsonia xyli subsp. xyli) و عامل کوتولگي مرغ (L. x. subsp. cynodontis) دو نمونه از باکتري هاي گرم مثبت ساکن آوندهاي چوبي مي باشند. اين باکتري ها داراي دامنه ميزباني نسبتاً محدود، واغلب به شکل ميله اي خميده و در محيط مصنوعي داراي رشد کند هستند (Davis and Vidaver 2001).
2-4- طبقه بندي ماليکيوت ها
2-4-1-توصيف رده ماليکيوت ها
اعضاي اين رده باکتريهايي هستند که بوسيله يک غشاء منفرد پوشيده شده اند، فاقد ديواره سلولي بوده و علاوه بر اين توانايي سنتز مواد اوليه از قبيل موراميک اسيد و دي-آمينوپمليک اسيد که جزو مواد سازنده ديواره سلولي هستند را ندارند (Martin et al., 1980; Plackett 1959). اين گروه از ميکروارگانيسم بسيار کوچک بوده که در حالت کروي قطر آنها در محدوده 300 نانومتر مي باشد (Boatman 1979). از نظر شکل ظاهري مي توانند بصورت کروي، مارپيچ يا رشته اي مشاهده شوند. البته برخي گونه ها حالت پلئومرف (چند شکلي) دارند و ممکن است در حالت رشته اي مسليوم شکل باشند (Baseman et al., 1982). بر طبق آخرين طبقه بندي، رده ماليکيوت ها در چهار راسته به شرح جدول زير (جدول 2-1) طبقه بندي شده اند (ICSB 1995).

جدول 2-1- طبقه بندي شاخه تنريکوتها

GenusFamilyOrderClassDivisionAcholeplasmaAcholeplasmataceaeAcholeplasmatalesMollicutesTenericutesCa. PhytoplasmaAnaeroplasmaAnaeroplasmataceaeAnaeroplasmatalesAsteroplasmaEntomoplasmaEntomoplasmataceaeEntomoplasmatalesMesoplasmaSpiroplasmaSpiroplasmataceaeCa. Hepatoplasma
MycoplasmataceaeMycoplasmatalesMycoplasmaUreaplasma
2-4-2-تاريخچه
راستهMycoplasmatales اولين بار در سال 1955 پيشنهاد گرديد (Freundet 1955) و بعداُ براي طبقه بندي ماليکيوتهايي (باکتري هاي بدون ديواره) که براي رشدشان نيازمند به استرول بودند مورد استفاده قرار گرفته است (Edward and Freundet 1967). پس از آن مشخص شد که برخي از گونه هاي جديد توصيف شده در جنس Mycoplasmaبه استرول يا کلسترول براي رشد نياز ندارند و بنابراين پيشنهاد گرديد که اين گروه به خانواده جديدAcholeplasmataceae و جنس Acholeplasma انتقال يابد (Tully 1979, (Edward and Freundet 1970. مطالعات اکولوژيکي آکولهپلاسماها مشخص کرد که اينها داراي يکسري ويژگي ها از جمله دامنه ميزباني گسترده ميباشند و ازجانوران، حشرات و سطح گياهان جدا مي گردند (Somerson et al., 1982, Eden-Green and Tully 1979). اندازه ژنوم در گونه هاي آکولهپلاسما دو برابر گونه هاي مايکوپلاسما که داراي اندازه تقريبي kbp 1500 مي باشد بوده و بنابراين اين خانواده بايد به راسته اي جديد (Acholeplasmatales) واقع در رده ماليکيوت انتقال داده شود (Freundet et al. 1984). بعد از آن ماليکيوتهاي بشدت بي هوازي و ساکن شکمبه گاو و گوسفند (جنس Anaeroplasma) به راسته Anaeroplasmatales واقع در کلاس ماليکيوت ها انتقال پيدا کرد (Robinson and Freundet 1987).
2-4-3-توصيف راسته Mycoplasmatales
سلولها غير مارپيچ، داراي اشکال متغيير از چندشکلي کروي با ضخامت nm 850-300 تا رشته اي کوتاه تا بلند، منشعب يا غير منشعب با عرض nm300- 200 و طول nm 1500 مي باشند. تعدادي از آنها داراي ساختمان انتهايي تخصص يافته هستند که ميتواند در اتصال به سلولهاي يوکاريوتي نقش داشته باشد. معمولاً غير متحرک هستند ولي اثبات شده است که برخي جدايهها به آرامي حرکت ميکنند و بيهوازي هستند. گونه هاي مخمري از سيستم آنزيمي فسفوترانسفراز قند وابسته به فسفوانول پيرووات استفاده ميکنند، کلني هاي اين باکتري کوچک ميباشد (mm1يا کوچکتر). شکل کلني ها از دانه دانه هاي ريز تا نيمرويي شکل متغيير مي باشد (شکل2-1). اعضاي اين راسته کموارگانوتروف بوده و از تمام قندها، آرژنين و اوره به عنوان منبع غذايي استفاده مي کنند. سلولها جهت رشد به کلسترول يا استرول هاي مربوطه نيازمند هستند، داراي محدوده دمايي رشد C?43-30 با بهينه دمايي C?37 مي باشند. اين ارگانيزمها انگل يا بيمارگر در تعداد زيادي از مهره داران هستند. ژنوم اينها حاوي 40-23 درصد C+G مي باشد و اندازه ژنوم اينها 1350-600 کيلو جفت باز ميباشد.UGA در تمام گونه ها تريپتوفان را کد مي کند (Tully et al., 1993). گونه تيپ در اين جنس Mycoplasma mycoides مي باشد.
شکل 2-1- کلني هاي ريز دانه دانه و نيمرويي شکل باکتري جنس Mycoplasma
2-4-4-توصيف راسته Entomoplasmatales
سلولها ممکن است غير مارپيچ (شکل 2-2) يا مارپيچ (شکل 2-3) باشند. سلولهاي مارپيچ در حالت رشد لگاريتمي داراي ضخامت nm200-100 و طول µm5-3 مي باشند. سلولهاي متحرک (داراي حرکت مارپيچ) و بدون ديواره سلولي ، تاژک و تاژکهاي پيراياختهاي هستند. همچنين ممکن است سلولها غير متحرک، چند شکلي کروي با ضخامتnm 500-300 يا به صورت رشته هاي کوتاه، منشعب يا غير منشعب باشند و بوسيله يک لايه غشايي محدود شده باشند. سلولها توانايي عبور از فيلترهاي nm450-220 را دارند و بي هوازي هستند. ارگانيزم هاي غير مارپيچ بر روي محيط حاوي 8/0درصد نوبل آگار کلني نيمرويي تشکيل ميدهند. ارگانيزم هاي مارپيچ بر روي محيط حاوي 8/0درصد نوبل آگار کلني هاي پراکنده ولي در محيط حاوي 25/2درصد نوبل آگار کلني هاي نيمرويي شکل توليد ميکنند. سلولها کموارگانوتروف هستند، از گلوکوز توليد اسيد مي کنند و ممکن است توانايي هيدروليز کردن آرژنين را داشته باشند يا نداشته باشند. سلولها جهت رشد ممکن است به سرم يا کلسترول نيازمند باشند يا نباشند و توانايي رشد بر روي محيط عاري از سرم حاوي 04/0درصد تووين 80 را دارند. در محدوده دمايي C?43-10 توانايي رشد دارند ولي بهينه دمايي رشد آنها C?32-30 مي باشد. اندازه ژنوم در اينها 2200-790 کيلو جفت باز ميباشد. درصدC+G در ژنوم اين ماليکيوتها 30-24 درصد است. در اين ميکروارگانيزمها UGA تريپتوفان را کد ميکند (Tully et al., 1993).

شکل 2-2- سلول هاي غير مارپيچ از باکتري جنس Entomoplasma
شکل 2-3- سلول هاي مارپيچ باکتري جنس Spiroplasma
2-4-5-توصيف راسته Anaeroplasmatales
سلولها در کشت هاي جوان (18-16 ساعت) حالت کروي داشته و ممکن است علاوه براين رشته هاي کوتاهي نيز به آن متصل باشد. توانايي عبور از فيلتر هايي با اندازه 400-200 نانومتر را دارند. سلولها در کشت هاي پير مي توانند به اشکال مختلف ديده شوند. غير متحرک، داراي يک غشاي منفرد بدون هيچ شاهد و مدرکي دال بر داشتن ديواره سلولي. بيهوازي اجباري بوده و بهينه دمايي رشد در اينها 37 درجه سليسيوس و بهينهpH آن 7-6.5 مي باشد. سطح زيرين کلني ها طلايي رنگ، غير منظم و اغلب داراي چند لوب ميباشد. سطح کلني حالت نيمرويي شکل دارد که ويژگي اغلب مايکوپلاسماها ميباشد (شکل 2-4). کموارگانوتروف هستند و استرين هاي آن توانايي يکساني در تخمير کربوهيدراتهاي متفاوت ندارند و همچنين توانايي هيدروليز آرژنين و اوره را نيز ندارند. نکته قابل توجه اين است که برخي از اين اعضاء توليد آنزيم هاي خارج سلولي ميکنند(Extra Cellular Enzyme) که مي تواند پپتيدوگلوکان موجود در ديواره سلولي باکتريها را هيدروليز کرده و از بين ببرد. اين ويژگي تاکنون در ديگر اعضاي رده ماليکيوت ها مشاهده نشده است (Robinson and Hungate 1973; Robinson and Allison 1975). لپيد هاي قطبي در برخي از گونه ها حاوي مادهاي بنامplasmalogens ميباشد. اين ماده عمدتا در باکتري هاي بيهوازي ديده ميشود. عليرغم وجود اين ماده ترکيب لپيدي گونه هاي مختلف اين راسته مشابه اعضاي بيهوازي اختياري رده ماليکيوت ها ميباشد (Longworthy et al., 1975). اعضاي اين راسته تاکنون از شکمبه گاو و گوسفند جدا شده اند (Robinson and Freundt 1987). اين راسته داراي يک خانواده بنام Anaeroplasmataceae و دو جنس مي باشد. جنس Anaeroplasma جهت رشد به استرول نيازمند بوده و ميزان C+G در ژنوم آن مابين 34-29 درصد متغيير است. جنس Asteroplasma جهت رشد به استرول نياز ندارد. ميزان C+G در ژنوم اين جنس 40 درصد و اندازه ژنوم در هر دو جنس تقريبا 1000 مگا دالتون مي باشد (Christiansen et al., 1986).
شکل 2-4- کلني هاي نيمرويي شکل حاصل از کشت باکتري جنس Anaeroplasma
2-4-6-توصيف راسته Acholeplasmatales
اين راسته براي اولين بار توسط ادوارد و فروندت (1967) توصيف گرديد. اعضاي اين راسته داراي سلولهايي کروي و غير متحرک با حداقل قطر 300 نانومتر و در حالت رشته اي داراي 5-2 ميکرومتر طول هستند. بطور عمومي در مقايسه با اعضاي راسته Mycoplasmatales در دماي 37 درجه سليسيوس به تنش هاي اسمزي حساسيت بيشتري از خود نشان ميدهند. کلني ها بر روي محيط کشت جامد حالت نيمرويي شکل دارد که ممکن است داراي قطري در حدود 3-2 ميلي متر باشد (شکل 2-5). بيهوازي اختياري بوده و اغلب استرين ها توانايي رشد بر روي محيطهاي ساده را دارند. اينها جهت رشد به استرول نياز ندارند. کموارگانوتروف بوده و اغلب گونهها توانايي استفاده از گلوکز و ديگر قندها به عنوان منبع اصلي انرژي دارند. انتقال کربوهيدراتها در اينها با آنچه در اعضاي راسته Mycoplasmatales اتفاق ميافتد متفاوت است. برخي از استرين ها توانايي سنتز اسيد هاي چرب را از استات دارند ولي توانايي هيدروليز آرژنين و اوره را ندارند. تمامي گونه ها به 5/1 درصد دجيتونين (digitonin) مقاوم بوده يا ممکن است به ميزان بسيار کم حساس باشند. اينها بر روي گياهان، حشرات و مهره داران بصورت گندرو، انگل يا همزيست زندگي ميکنند ولي گزارشي مبني بر بيماريزا بودن وجود ندارد. ميزان C+G دز ژنوم اينها مابين 36-27 درصد متغيير ميباشد. اندازه ژنوم در حدود 10 مگا دالتون بوده و مابقي ويژگيها شبيه ساير اعضاي ماليکيوت ميباشد (Freundt et al., 1984). خانواده تيپ در اين راسته Acholeplasmataceae و جنس تيپ Acholeplasma ميباشد (Freundt and Edward 1970).
شکل 2-5- کلني هاي نيمرويي شکل حاصل از کشت باکتري جنسAcholeplasma
2-5- فيتوپلاسماها
2-5-1- مقدمه
فيتوپلاسماها با نام قبلي موجودات شبه مايکوپلاسما(MLO)، درسلسله پروکاريوتها و رده ماليکيوتها (Mollicutes) و گروه Lactobacillus طبقه بندي ميشوند (Woese, 1987) و بواسطه داشتن اندازه کوچک (3/.-5/. ميکرومتر) و همچنين نداشتن ديواره سلولي (شکل 2-6)، در رده ماليکيوتها تشکيل يک جنس دادهاند (Marwitz , 1990).

شکل 2-6- سلول هاي فيتوپلاسمايي واقع در آوند ابگشي گياهان آلوده

2-5-2- عمده تشابه فيتوپلاسماها به ماليكيوت ها
I. اندازه كوچك ژنوم که داراي اندازه اي در محدوده 1350-600 کيلو جفت بازميباشد.
II. محتوي اندك مجموع G +C در ژنوم که مابين 30-25 درصد متغيير ميباشد.
III. امكان تكثير 16S rRNA آنها با آغازگرهاي عمومي ماليكيوت ها.
IV. تشابه تواليهاي16S rRNA آنها باساير اعضاي ماليكيوت ها.
در حال حاضر اين گروه از بيمارگرهاي گياهي در شبه جنس فيتوپلاسما (Ca. Phytplasma)، خانواده Acholeplasmataceae و راسته Acholeplasmatalesقرار ميگيرند. تا کنون جهت رده بندي جنس فيتوپلاسما از ژن ريبوزومي16S استفاده گرديده است. اين ژن در فيتوپلاسماهاي مختلف ميزان بالاي حفاظت شدگي را نشان ميدهد.در سال 2004 (IRPCM 2004 and Firrao et al., 2005) پيشنهاد گرديد که فيتوپلاسماها در شبه جنس فيتوپلاسما بر اساس تعريف پيشين اين جنس (Lee et al., 1998) که براساس گروهبندي16S بود، قرار گيرد. ژن ريبوزومي فيتوپلاسماهاي مختلف پس از هم رديف سازي با بکارگيري نرم افزار هاي کامپيوتري و درصد تشابه و تفاوت رده بندي ميشوند. به عنوان مثال چنانچه دو توالي ريبوزومي فيتوپلاسمايي داراي شباهت کمتر از 5/97 درصد باشند، در دو کلاستر (دو گروه) مجزا قرار مي گيرند. علاوه بر اين فيتوپلاسماها بر اساس الگوي برشي ژن ريبوزومي توانايي رده بندي شدن به گروه و زير گروه هاي مختلف را دارند. اخيرا از توالي نوکلئوتيدي ژن هاي ديگر نيز جهت تعيين زير گروه هاي شبه جنس فيتوپلاسما استفاده گرديده است. به عنوان مثال در تحقيقي، بيست نمونه از فيتوپلاسماهاي گروه يک (Aster yellows) با بکارگيري ژن secY به ده زير گروه تقسيم شدند در حالي که همين نمونه ها با بکارگيري ژن ريبوزومي 16S به شش زير گروه تقسيم بندي گرديدند (Lee et al., 2006).
2-5-3- موقعيت تاکسونومي فيتوپلاسماي عامل عامل تورم جوانه
Domain:Bacteria
Phylum: Tenericuts
Class:Mollicutes
Candidatus(Ca.) genus Phytoplasma
: Tomato big bud
2-5-4- مرفولوژي فيتوپلاسماها
اين گروه از پاتوژن هاي گياهي يک شبه جنس را در رده ماليکيوت ها تشکيل ميدهند. اينها از ويروسها بزرگتر بوده از صافي هاي نگهدارنده باکتري ها عبور ميکنند. بيمارگرهاي مذکور بدون تاژک يا زوائد خارجي ديگر ميباشند. کروموزوم در اينها بصورت کلاف دو رشته اي و حلقوي ميباشد و داراي اندازه تقريبي معادل 1249-600 کيلو جفت باز مي باشد (Firrao et al., 2005). در مقطع گيري از آوند آبکشي، اينها بصورت رشته هاي منشعب (Branching filamentous) و گسترده در سرتاسر طول آوند مشاهده مي شوند و ميانگين قطر در اينها 800-200 نانومتر ميباشد (Lee et al., 2000 and Kirkpatrick et al., 1992). اگرچه مطالعات الکترون ميکروسکوپي نميتواند فيتوپلاسماهاي مختلف را از يکديگر جدا کند ولي مي تواند بعنوان يک ابزار مهم براي مطالعه اتيولوژي عوامل فيتوپلاسمايي در مقايسه با ساير عوامل ناشناخته مورد استفاده قرار گيرد (McCoy et al., 1989).
2-5-5- علائم بيماري هاي فيتوپلاسمايي


پاسخ دهید