2-2-1-2-5. دماي ستون 29
2-2-1-2-6. آشکارسازها 30
2-2-1-2-6-1.آشکارساز فتومتريک 31
2-2-1-2-6-2.آشکارساز جذب فرابنفش (UV)32
2-3.بررسي مطالعات ديگران در اين زمينه 33
2-4.بررسي داروي مورد مطالعه 36
2-4-1.مکانيسم اثر فارماکوکينتيک دارو36
2-4-2.مکانيسم اثر37
2-4-3. موارد مصرف 37
2-4-4.منع مصرف و احتياط 37
2-4-5.عوارض جانبي 38
2-4-6. تداخل‌ها 38
2-4-7.دوز مصرفي 38
2-5. ميکرواستخراج سه فازي بر پايه استفاده از فيبر توخالي متخلخل38
2-5-1.از دلايل انتخاب اين روش39
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1.مواد شيميايي و تجهيزات دستگاهي41
3-2-1. مواد شيميايي، استانداردها و نمونه‌هاي حقيقي 41
3-2-2.تجهيزات دستگاهي 41
3-3.روش استخراج 42
3-3-1.استخراج به اختصار طي مراحل زير انجام گرفت42
3-3-2. مراحل بهينه‌سازي 43
3-3-2-1. بهينه‌سازي شرايط جداسازي43
3-3-2-2. بهينه‌سازي شرايط استخراج 43
3-3-2-2-1.نوع حلال آلي 44
3-3-2-2-2.اثرpHفاز دهنده 44
3-3-2-2-3.اثرpHفاز گيرنده 44
3-3-2-2-4.اثر قدرت يوني فاز دهنده 44
3-3-2-2-5.اثر هم زدن محلول آناليت 44
3-3-2-2-6.اثر زمان استخراج 44
3-3-3. ارزيابي کارايي روش استخراج 45
3-3-3-1. منحني درجه‌بندي 45
3-3-3-2.تعيين فاکتور پيش تغليظ (PF) 45
3-3-3-3. تعيين تکرارپذيري (RSD) 46
3-3-4.آناليز نمونه حقيقي 46
فصل چهارم: نتايج
4-1. ميکرواستخراج سه فازي بر پايه استفاده از فيبر توخالي متخلخل 48
4-2. مراحل بهينه‌سازي48
4-2-1. بهينه‌سازي شرايط HPLC48
4-2-2. بهينه‌سازي شرايط استخراج 49
4-2-2-1.نوع حلال آلي49
4-2-2-2.طراحي آزمايش51
4-2-2-2-1. غربال‌گري 51
4-2-2-2-2. طراحي بهينه‌سازي 55
4-2-2-2-3. خلاصه نتايج بهينه‌سازي 59
4-3. تعيين پارامترهاي تجزيه‌اي روش استخراج 59
4-3-1.تهيه منحني درجه‌بندي 59
4-3-2.فاکتور پيش تغليظ (PF) و درصد بازيابي (R%) 60
4-3-3.تعيين حد تشخيص (LOD) 61
4-3-4. تکرارپذيري روش (RSD) 62
4-4.آناليز نمونه ادرار و پلاسما 62
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
5-1. بحث و نتيجه‌گيري66
5-2. پيشنهادات69
منابع70
خلاصه انگليسي 82
ضمايم82
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 2-1. کاربردهاي کروماتوگرافي تقسيمي 25
جدول 2-2. کاربردهاي اخير HF-LPME در استخراج گونه‌هاي مختلف 33
جدول 4-1. سطوح پايين و بالاي مربوط به فاکتورهاي بررسي شده 52
جدول 4-2. آزمايشات طراحي شده پلاکت- بورمان جهت شناسايي فاکتورهاي مهم تاثيرگذار بر روي نتايج SBME-HPLC براي جداسازي و اندازه‌گيري donepezil52
جدول 4-3. آزمايشات طراحي شده باکس- بهکن جهت بهينه‌سازي فاکتورهاي موثر بر SBME55
جدول 4-4. خلاصه نتايج بهينه‌سازي استخراج59
جدول 4-5. ارقام شايستگي SBME داروي دونپزيل62
جدول 5-1. مقايسه روش ارائه شده با ساير روش‌هاي استخراجي66
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل ( الف ). روش‌هاي استخراج و ميکرواستخراج 3
شکل 2-1. نماي جانبي از سيستم ميکرواستخراج با حلال با استفاده از ميله تفلوني 11
شکل 2-2. نماي جانبي از سيستم ميکرواستخراج با تک قطره الف)استخراج مستقيم ازدرون محلول ب)استخراج از فضاي فوقاني 13
شکل 2-3. اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازي (ب) سه فازي 14
شکل 2-4. (الف) سيستم HF-LPME بر اساس پيکربندي (ب) پيکربندي ميله‌اي U17
شکل 2-5. طرح شماتيک از سيستم HF-LPME18
شکل 2-6. (الف): شمايي از سيستم HF-LPME از حجم زياد (ب) سيستم نيمه خودکار 19
شکل 2-7. طرح شماتيک ميکرواستخراج فاز مايع به روش مستقيم (الف) و (ب) فضاي فوقاني 21
شکل 2-8. شمايي از يک دستگاه HPLC26
شکل 2-9. يک حلقه نمونه‌برداري کروماتوگرافي مايع 28

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

شکل 2-10. سلول آشکارساز فرابنفش براي HPLC32
شکل 2-11. ساختار شيميايي دونپزيل 36
شکل 4-1.کروماتو گرام تزريق مستقيم 1ميلي‌گرم بر ليتر محلول ابي دونپزيل 49
شکل 4-2. بررسي نوع حلال پر کننده منافذ فيبر 50
شکل 4-3. نمودار Pareto chart مربوط به طراحي پلاکت- بورمان 54
شکل 4-4. نمودار مربوط به ميزان و نحوه تغيير سطوح فاکتورهاي موثر انتخاب شده 56
شکل 4-5. نمودار پاسخ سطحي تخميني و خطوط کانتور به دست آمده از فاکتورهاي موثر در کارايي استخراج donepezil توسط روش SBME-HPLC57
شکل 4-6. منحني درجه‌بندي در شرايط بهينه SBME59 شکل 4-7. منحني درجه‌بندي در محيط آبي حاصل از تزريق دارو قبل از استخراج 60
شکل 4-8. منحني درجه‌بندي تزريق مستقيم 61
شکل 4-9. کروماتوگرام نمونه ادرار حاوي 10 ميکروگرم بر ليتر دارو63
شکل 4-10. کروماتوگرام نمونه پلاسما حاوي 10 ميکروگرم بر ليتر دارو64
خلاصه فارسي
داروي دونپزيل يک مهار کننده مرکزي آنزيم استيل کوليناستراز است که در موارد خفيف تا شديد بيماري آلزايمر بهکار مي‌رود. همچنين در برخي موارد در درمان بيش فعالي و نيز موارد دمانس مرتبط با پارکينسون مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
در اين مطالعه براي تغليظ و اندازه‌گيري مقادير کم اين دارو در نمونه‌هاي بيولوژيک ادرار و پلاسما، ترکيبي از روش ميکرواستخراج سه فازي مايع با نوار حلال و اندازه‌گيري با کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا(HPLC)، به کار گرفته شد که بسيار موفقيت‌آميز بود.
استخراج دارو از محلول آبي 15 ميلي‌ليتري که حاوي دارويدونپزيل در 9/11 pH=بود، به فاز آلي که شامل حلال n-اکتانولي که در منافذ فيبرتوخالي جاي داده شده بود، صورت گرفت. سپس به منظور تغليظ، داروي وارد شده در فاز آلي با يک عمل استخراجي برگشتي، به فاز آبي با 4 /3pH= که در داخل فيبر توخالي قرار داشت، منتقل گرديد.
فرآيند استخراج به دليل گراديان و اختلاف pH بين دو فاز آبي انجام مي‌شود. به منظور دستيابي به بيشترين فاکتور تغليظ، پارامترهاي موثر در استخراج نظير نوع حلال آلي، pH فاز دهنده و گيرنده، قدرت يوني، زمان، سرعت همزدن و دما بررسي و بهينه شدند.
پس از استخراج تحت شرايط بهينه، فاکتور تغليظ 7/106، و حد تشخيص87/0?g/Lبا انحراف معيار نسبي 9/2 درصد حاصل شد.
كليد واژه: دونپزيل – ميکرو استخراج سه فازي مايع با نوار حلال
مقدمه
علم شيمي تجزيه روشهاي متنوعي را براي آناليز کمي و کيفي مواد ارائه ميدهد. امروزه روشهاي جداسازي، تفکيک گونهاي موجود در بافت‌هاي پيچيده را با حد تشخيصي در حد خيلي کم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روشهاي جداسازي، مرحلهي آماده‌سازي نمونه نيز يکي از مهمترين مراحل در روند تجزيه ميباشد. اين مرحله شامل تبديل بافت يک نمون? حقيقي به حالتي است که براي تجزيه با يک تکنيک جداسازي و يا روشهاي ديگر مناسب باشد. ميتوان گفت مرحلهي آماده‌سازي نمونه براي اهداف زير طراحي شده است:
1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزايش گزينش‌پذيري روش
2- پيش تغليظ آناليت مورد نظر و افزايش غلظت آن به نحوي که بتوان آنرا با دستگاه‌هاي تجزيهاي اندازه‌گيري کرد.
3- تبديل آناليتها به فرمي که براي شناسايي با دستگاه تجزيهاي مناسب باشد.
اساسي‌ترين روش آماده‌سازي نمونه، روش استخراج است. تلاش متخصصين شيميتجزيه براي ابداع و توسعهي روشهاي اندازهگيري با دقت و صحت بالا و نيز حذف مراحل دستي که موجب تکرارپذيري پايين در روشهاي تجزيهاي ميشود، باعث شده که روشهاي استخراجي نويني ابداع گردد. شکل (الف)روشهاي مختلف استخراج و ميکرواستخراج را دستهبندي ميکند که راجع به آنها توضيحات مفصلي در مراجع آمده است.
در فصل دوم نيزبه اختصار راجع به ميکرواستخراج مايع- مايع با قطره روشهاي استخراج برپايه استفاده از فيبرهاي توخالي متخلخل بحث خواهد شد.
شکل (الف). روش‌هاي مختلف استخراج و ميکرو استخراج
فصل اول
كليات
1-1. بيان مسأله
جهت اندازه‌گيري مقادير بسيار اندک دونپزيل در مايعات بيولوژيک، مي‌بايست از متودي استفاده شود که به تيم پزشکي در تنظيم دوز دارو بدون نياز به خونگيريو از طريق غير تهاجمي کمک کند و قدرت شناسايي و تفکيک اين دارو را داشته باشد.با استفاده از متود پيش تغليظ دارو با ميکرواستخراج فاز مايع به کمک هالوفايبر مي‌توان مقادير بسيار کم اين دارو را در ادرار تغليظ و استخراج نمود، سپس با دستگاه HPLC اندازه‌گيري کرد.اين روش بسيار جديد بوده و تا به حال جهت پيش تغليظ و اندازه‌گيري اين دارو استفاده نشده است.
1-2. ضرورت اهميت موضوع
بر طبق مطالعات داروي دونپزيل مي‌تواند باعث افزايش غلظت داروهايي از جمله بتا- بلاکرها و داروهاي کولينرژيک شود. از طرفي مي‌تواند باعث کاهش اثرات درماني داروهاي آنتي‌کولينرژيک از جمله تولترودين شود که در موارد تکرر ادرار در سنين سالمندي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. همچنين اين دارو در موارد مصرف کنترل نشده و در غلظت‌هاي بالاتر از سطح درماني مي‌تواند باعث افزايش فشار خون و حتي سنکوپ شود.
غلظت خوني اين دارو در پلاسما در حدود 17-7 نانوگرم در ميلي‌ليتر مي‌باشد و دارو به مقدار 17% به صورت تغيير نيافته از ادرار دفع مي‌شود. اندازه‌گيري دارو در نمونه بيولوژيک ادرار و پلاسما، به منظور بررسي‌هاي فارماکوکينتيکي و کلينيکال و تعيين دوز مصرفي در بيماران، باتوجه به مصرف رو به گسترش آن، حائز اهميت مي‌باشد.
فصل دوم
مروري بر متون گذشته
اصول تئوري
در SBME بر پاي? استفاده از فيبر (نوار حلال)، محلول نمونه داخل يک ظرف قرار گرفته و تکهاي از فيبر که دو طرف آن بسته استتا 5 سانتيمتر باشد داخل محلول قرار ميگيرد.
قبل از عمل استخراج فيبر داخل يک حلال آلي قرار ميگيرد تا داخل منافذ آن با حلال آلي پر شود سپس حلال اضافي روي فيبر با آب شسته ميشود. گفتني است که حلال آلي بايد غير قابل امتزاج با آب باشد. لاي? نازک تشکيل شده از فاز آلي ضخامتي در حدود 200 ميکرومتر دارد و کل فاز آلي استفاده شده در اين فرآيند در حدود 15تا 20 ميکروليتر است. فيبر آماده شده طي استخراج داخل محلول آناليت قرار ميگيرد. آناليت ابتدا به داخل فاز آلي مستقر در جدار? فيبر و سپس به فاز گيرندهي مستقر در داخل فيبر منتقل ميشود. پس اگر A آناليت استخراجي باشد در يک سيستم دو فازي ميتوان تعادل آن را بصورت زير نشان داد.
AaqAorg
در اينجاCeq.organic غلظت A را در فاز گيرنده و Ceq,sample غلظت A را در محلول نمونه در حالت تعادل نشان ميدهد. براساس معادل? (2-2) و معادل? تعادل جرمي سيستم دو فازي، ميتوان راندمان استخراج(R) را براي آناليت A محاسبه کرد:
در اينجا Vorgحجم کل فاز آلي در سيستم (فاز آلي جذب شده در منافذ فيبر و داخل فيبر) و Vsample حجم نمونه را نشان ميدهد. رابطه (2-3) نشان ميدهد کارايي استخراج به ثابت تفکيک، حجم حلال آلي و نيز حجم نمونه بستگي دارد. براي ترکيباتي که Kacceptor/sampleبزرگي دارند کارايي استخراج بالايي بدست ميآيد. پس ميتوان با انتخاب حلال آلي مناسب و با انتخاب pH مناسب براي تر کيبات اسيدي و بازي ودر بعضي موارد با افزايش قدرت يوني نمونه به کارايي بالايي از استخرج دست يافت. همچنين استفاده از حجم‌هاي کم نمونه باعث دستيابي به درصدهاي استخراج بالايي مي‌شود.
همچنين درصد بازيابي آناليت نيز توسط معادله زير قابل محاسبه است:

: غلظت اوليه آناليت در محلول نمونه
: حجم محلول آبي نمونه (فاز دهنده)
: حجم حلال آلي (فاز گيرنده)
CO: غلظت آناليت در فاز گيرنده در پايان استخراج است.
در SBME دوفازي، بازيابي واقعي كمتر از مقدار محاسبه شده مي‌باشد، چرا كه كسري از حلال آلي كه در منافذ فيبر قرار گرفته، در استخراج نقشي ندارد و فقط كسر موجود در مجراي فيبر مي‌تواند به درون سرنگ كشيده شود.کينتيک استخراج براي يک سيستم دو فازي ميتواند بصورت معادله زير نوشته شود:
Cacceptor= Ceq,acceptor(1-e-kt)
Ceq.acceptorغلظت آناليت A در فاز گيرندهدر زمانt، مي‌باشد.
در رابطه، K ثابت سرعت با واحد (S-1) و مقدار آن از رابطهي ذيل قابل محاسبه است:
(2-6)
Ai و ثابتهاي انتقال جرم در فاز آلي را نشان مي‌دهد اين معادله نشان ميدهد اگر Aiوبزرگ باشند وVsample کوچک باشد، استخراج با سرعت بيشتري انجام ميشود.با افزايش سرعت همزدن ميتواند به ماکزيمم مقدار خود برسد.
در مدل سه فازي، آناليت از نمون? آبي به يک فاز آلي و سپس به فاز گيرنده که يک محلول آبي است و داخل فيبر را پر ميکند وارد ميشود. اين فرآيند بصورت معادل? تعادلي زير نوشته ميشود:
AaqKorg/sampleAorgKacceptor/orgAac
دراينجا Korg/ sampleوKacceptor /org به عنوان ثابت‌هاي توزيع تعريف ميشوند:
(2-8)
بر اساس معادلات فوق و نيز بر پاي? تعادل جرم براي سه فاز مقدار R از رابطهي زير محاسبه ميشود:
Vacceptorحجم فاز گيرنده و Vorgحجم فاز آلي مستقر در داخل منافذ فيبر ميباشد. معادل? فوق نان مي‌دهد راندمان استخراج در سيستم سه فازي از طريق ثابت‌هاي توزيع، حجم نمونه و حجم فاز آلي و حجم فاز گيرنده کنترل ميشود. در کل داشتن ثابت توزيع بالا براي انجام استخراج خيلي مهم است که ميتواند با انتخاب مناسب فاز آلي و نيز تنظيم pH نمونه حاصل شود. براي آناليت‌هاي بازي pH نمونه بايد بالا باشد (تقريباً سه واحد بزرگتر از PKaآناليت) در حالي که pH فاز گيرنده بايد اسيدي باشد (ترجيحاً سه واحد کوچکتر از PKa آناليت). بصورت عکس براي آناليت اسيدي شرايط معکوس بايد مهيا باشد. با توجه به معادل? (2-11) ميتوان براي SBME فاکتور تغليظ بالايي انتظار داشت به شرط اينکه ثابت توزيع آناليت بزرگ باشد.
در مدل سه فازي، كل حجم فاز گيرنده براي استخراج در دسترس مي‌باشد، بنابراين درصد بازيابي از معادله زير به دست مي‌آيد (67).
2-1. مروري بر روشهاي استخراج مايع- مايع و ميكرواستخراج مايع- مايع1
استخراج مايع- مايع بر مبناي توزيع گونه بين دو فاز امتزاج‌ناپذير كه معمولاً يكي از آن‌ها آب و ديگرييك حلال آلي است استوار است. در اين روش اساس جداسازي توزيع است (1و2).
عوامل مؤثر در استخراج مايع- مايع عبارتند از:
نوع حلال استخراج كننده، حجم حلال آلي براي استخراج، pH، عامل استخراج، عامل پوشاننده و قدرت يوني محيط.
استخراج مايع- مايع يكي از قديمي‌ترين روش‌هاي جداسازي است، سادگي و كاربردي بودن در مقياس تجزيه‌اي و صنعتي از عوامل بقاي اين روش تا امروز بوده است. از مهم‌ترين معايب اين روش مصرف زياد حلال آلي و آلودگي محيط زيست، هزينه حلال آلي و ايجاد سميت مي‌باشد. در همين راستا با پيشرفتي كه در اين روش صورت گرفت و با كم كردن مقدار حلال آلي استخراجي، روش‌هاي ميكرواستخراج با حلال روي كار آمدند كه در اين روش‌ها حجم حلال آلي مصرفي به مقدار قابل توجهي كاهش مي‌يابد (3).
روش‌هاي ميكرواستخراج با حلال شامل موارد زير مي‌باشد:
1- ميكرو استخراج فاز مايع با تك قطره2(SDME)
2-ميكرو استخراج فاز مايع توسط غشاي فيبر توخالي3(HF-LPME)
3- ميكرو استخراج فاز مايع با استفاده از انجماد حلال استخراج كننده
4- ميكرو استخراج فاز مايع- مايع پخشي4(DLPME)
2-1-1.ميكرواستخراج فاز مايع
2-1-1-1.ميكرواستخراج فاز مايع با تك قطره
Liu و Dasgupta اولين محققاني بودند كه از يك قطره‌ي كوچك جهت تغليظ و استخراج استفاده نمودند. آنها با به كار بردن يك ميكرو قطره‌ي آلي از جنس كلروفرم به صورت معلق در يك قطره آبي در حال جريان (سيستم قطره در قطره) توانستند سديم دو دسيل سولفات را به صورت زوج يون با متيلن بلو به داخل كلروفرم استخراج نمايد(4).تقريباً در همان زمان Jeannotو Cantwellروشي را معرفي کردند که آن را ميكرو استخراج با حلال ناميدند (5).در اين روش يک قطره8 ميکروليتري از حلال آلي n-اکتان حاوي مقدار ثابتي از استاندارد داخلي در انتهاي ميلهي تفلوني قرار ميگرفت و ميلهي تفلوني به محلول آبي در حال چرخش که حاوي آناليت بود وارد ميشد. بعداز اتمام استخراج، ميله تفلوني از محلول آبي بيرون کشيده شده واز فاز آلي براي آناليز به دستگاه کروماتوگرافي گازي تزريق ميگرديد.
شکل 2-1. نماي جانبي از سيستم ميکرو استخراج با حلال با استفاده از ميلهي تفلوني
در سال 1997 به موازات تحقيقات Jeannot و Cantwell روي ميکرواستخراج با قطره،HeوLeeاستخراج با قطره را در حالت استاتيك و ديناميك انجام دادند (6).در روش استاتيك، يك ميكروليتر از قطره‌ي استخراجي در نوك سوزن ميكروسرنگ معلق شده، در تماس با محلول آبي قرار گرفته و استخراج گونه از فاز آبي به داخل قطره انجام مي‌گيرد. در روش ديناميك، پيستون ميكروسرنگ به صورت قيف جدا كننده عمل مي نمايد. با كشيدن پيستون و ورود محلول آبي به داخل ميكروسرنگ، لايه‌ي نازكي از فازآلي در جدار داخلي سرنگ و سوزن تشكيل شده و همرفت القاء شده در اثر حركت پيستون منجر به استخراج گونه‌ها از فاز آبي به لايه آلي مي‌گردد (7). ميكرو استخراج با قطره به دو شيوه دوفازي و سه فازي قابل انجام است. در ميكرو استخراج دو فازي، استخراج گونه‌ها به درون يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب رخ مي‌دهد. در ميكرواستخراج سه فازي يا ميكرواستخراج مايع- مايع- مايع5، گونه‌ها از نمونه به درون حلال آلي و سپس با استخراج برگشتي به درون فاز آبي پذيرنده استخراج مي‌شوند.
در ميكرو استخراج با قطره (دو فازي يا سه فازي) به دليل انتقال گونه‌ها از نمونه‌هاي با حجم چند ميلي‌ليتر به داخل ميكرو قطره‌اي با حجم ميكروليتر، فاكتور تغليظ بالايي براي مواد مختلف به دست مي‌آيد. وجود يك مرحله استخراج برگشتي در سيستم سه فازي، انتخابگري سيستم را بالا مي‌برد، چرا كه طي آن بسياري از مولكول‌هاي خنثي حذف گرديده و روش از قدرت پاكسازي6 بالايي براي نمونه‌هاي با ماتريس پيچيده برخوردار مي‌گردد. با انتخاب حلال آلي مناسب، كاهش نسبت به حجم ميكرو قطره‌ي پذيرنده به نمونه، تنظيم شرايط و pH فازهاي دهنده و گيرنده و نيز با به كارگيري واكنشگرهاي كمكي در فاز استخراجي به منظور به دام‌اندازي گونه‌ها، مي‌توان كارايي استخراج را افزايش داد (8).
قرارگيري حلال استخراجي در معرض بافت پيچيده‌ي نمونه و انحلال جزئي حلال در آب، دشواري نگهداري قطره درون محلول، عدم امكان استفاده از دماهاي بالا و ناپايدار شدن قطره طي هم زدن محلول، همچنين كشيده شدن مقداري از محلول همراه با قطره به درون ميكروسرنگ در انتهاي كار از جمله معايب روش SDME مي‌باشد. Jennot و همكارانش در سال 2001 با هدف رفع اين محدوديت‌ها ايده‌ي استفاده از قطره‌ي حلال در فضاي فوقاني7 را مطرح نمودند (9).
در اين روش كه ميكرواستخراج با حلال از فضاي فوقاني ناميده مي‌شود، قطره براي زماني معلوم در تماس با فضاي فوقاني نمونه قرار گرفته و استخراج گونه‌ها از محلول به فضاي فوقاني و از آنجا به درون قطره انجام مي‌پذيرد.
HS-SDME روشي ساده، حساس و ارزان است و جهت استخراج تركيبات فرار و نيمه فرار از نمونه‌هاي با بافت پيچيده بسيار مناسب مي‌باشد(11، 10). به منظور افزايش تكرارپذيري استخراج، اين روش توسط دستگاه‌هاي نيمه خودكار و تمام خودكار نيز انجام پذيرفته است. در شكل(2-1)نمايي از سيستم ميكرواستخراج با قطره به دو شيوه استخراج مسقيم و استخراج از فضاي فوقاني نشان داده شده است.
شکل 2-2. نماييازسيستم ميکرو استخراج باتک قطرهالف) استخراج مستقيم از درون محلول ب) استخراج از فضاي فوقاني
2-1-1-2. ميكرو استخراج فاز مايع با فيبر توخالي(HF-LPME)
روش LPME با تك قطره به صورت دو فازي و سه فازي از مزايايي همچون مصرف مقادير بسيار كم از نمونه و حلال آلي، حساسيت و فاكتور تغليظ بالا، قابليت انجام به صورت استاتيك و ديناميك و قدرت پاكسازي بسيار مطلوب براي نمونه‌هاي پيچيده برخوردار است.
مهم‌ترين عيب روش از آنجا ناشي مي‌شود كه نگهداري قطره‌ي استخراجي در انتهاي ميكروسرنگ بويژه براي زمان‌هاي طولاني و تحت هم زدن شديد محلول دشوار بوده و به شرايط و مهارت خاصي نيازمند است.به منظور غلبه بر مشكلات فوق و نيز استفاده از فازهاي گيرنده‌اي با حجم بيشتر،Pedersen- Bjergaard Rusmussen در سال 1999 استفاده از فيبرهاي توخالي متخلخل از جنس پلي پروپيلن را به عنوان نگهدارنده‌اي جهت حفظ مكانيكي فاز استخراجي پيشنهاد نمودند كه تحت عنوان ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي نام گرفت (13، 12). در واقع تكنيك LPME-HF، نوعي روش ميكرواستخراج با غشاي مايع نگهداري شده مي‌باشد8 كه در آن حلال آلي توسط نيروهاي كاپيلاري درون منافذ فيبر قرار مي‌گيرد و لايه نازكي را نيز روي ديواره‌ي فيبر تشكيل مي‌دهد. فاز استخراجي كه در حد چند ميكروليتر مي‌باشد داخل مجراي دروني فيبر وارد مي‌گردد. حجم فاز آلي مورد استفاده در اين روش در قياس با روش سه فازيLPME با قطره كمتر بوده و از سويي امكان تشكيل امولسيون كه از مشكلات متداول روش LLE است، حذف مي‌گردد.
2-1-1-2-1.اصول استخراج و سيستم‌هاي مختلف در استفاده از LPME-HF
شكل (2-3)، اصول روش ميكرواستخراج فاز مايع با فيبرتوخالي را نشان مي‌دهد (14). محلول آبي نمونه درون يك ظرف كوچك پر مي‌شود و تكه‌اي از يك فيبر توخالي از جنس پلي پروپيلن متخلخل درون نمونه قرار داده مي‌شود. حجم نمونه آلي معمولاً در حد چند ميلي‌ليتر و طول فيبر، بسته به نوع كاربرد، در حد چند سانتي‌متر است. پيش از استخراج، فيبر در يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب آغشته مي‌شود تا حلال منافذ فيبر را پركند. بدين ترتيب، لايه نازكي از حلال آلي در جداره‌ي فيبر، كه معمولاًl?200ضخامت دارد، تشكيل مي‌شود. حجم كلي حلال آلي تثبيت شده در غشاء معمولاًl?20-15مي‌باشد. براي گونه‌هاي قابل يونيزاسيون، pH محلول به گونه‌اي تنظيم مي‌شود كهگونه‌ها به شكل غيريوني خود وجود داشته باشند تا حلاليت‌شان در نمونه آبي كم شود و قابليت استخراج‌پذيري آنها به درون حلال آلي افزايش يابد. بدين ترتيب، گونه‌هاي موجود در نمونه‌ي آبي از ميان فاز آلي تثبيت شده در غشاي فيبر به درون محلول گيرنده موجود در مجراي دروني فيبر استخراج مي‌شوند. براي تسريع اين فرآيند، هم زدن و چرخش سريع نمونه به كار گرفته مي‌شود. محلول گيرنده مي‌تواند از جنس همان حلال آلي تثبيت شده در منافذ غشاي فيبر باشد كه در اين صورت تشكيل يك سيستم دوفازي را مي‌دهد و گونه‌ها در يك فاز آلي استخراج مي‌شوند (16، 15). ميكرو استخراج فاز مايع با سيستم دو فازي بيشتر براي گونه‌هايي به كار گرفته مي‌شود كه حلاليت‌شان در يك حلال آلي غيرقابل امتزاج با آب به ميزان قابل توجهي بيشتر از محيط آبي است. در اين روش، فاز استخراجي مستقيماً با GC سازگار است، در حالي كه براي آناليز با HPLCيا 9CE به تبخير حلال و تركيب دوباره در محيط آبي نيازمند مي‌باشد.
شکل 2-3. اصول استخراج HF- LPME (الف) دو فازي (ب) سه فازي
در سيستم سه فازي، محلول گيرنده فاز آبي ديگري است كه در آن گونه موجود در نمونه آبي از طريق فيلم نازكي از حلال آلي در غشا به درون محلول آبي پذيرنده استخراج مي‌شود. اين شيوه استخراجي به گونه‌هاي بازي و اسيدي با گروه‌هاي عاملي يونيزه شونده محدود مي‌شود. براي استخراج تركيبات بازي، pH نمونه بايستي در ناحيه قليايي تنظيم شود تا از حلاليت آناليت جلوگيري كند. در حالي كه pH محلول گيرنده بايد پايين باشد تا اينكه حلاليت گونه در آن افزايش يابد. در اين صورت گونه‌ها به شكل خنثي وارد فاز آلي شده و مجدداً با تبديل به شكل يوني به فاز گيرنده، استخراج مي‌شوند. در مورد تركيبات اسيد pH فاز دهنده در ناحيه اسيدي و pH فاز گيرنده در ناحيه قليايي تنظيم مي‌شود. در نهايت فاز استخراجي مستقيماً مي‌تواند به دستگاه‌هاي CE، HPLC و يا LC-MSتزريق گردد.
ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي به شكل ديناميك هم مي‌تواند انجام شود. در سيستم دوفازي، يك ميكروسرنگ با چند ميكروليتر از حلال آلي غيرقابل امتزاج با آب پر مي‌شود (17). تكه كوچكي از فيبر توخالي به سوزن ميكروسرنگ متصل شده، فيبر توخالي براي چند ثانيه داخل حلال آلي گذاشته مي‌شود تا منافذ فيبر از حلال آلي پر شود. سپس سوزن سرنگ به همراه فيبر در نمونه آبي قرار داده مي‌شود و در طول استخراج، حجم‌هاي كوچكي از نمونه آبي به طور پي در پي به درون فيبر كشيده و خالي مي‌شود. در طي كشيدن نمونه آبي به درون سرنگ، فيلم نازك حلال آلي در جداره فيبر شديداً آناليت را از محلول نمونه استخراج مي‌كند، در حالي كه در طي بيرون راندن نمونه، اين فيلم نازك دوباره با فاز آلي درون سرنگ تركيب مي‌شود. در طول فرايند تركيب شدن دوباره حلال، بخشي از گونه‌ي استخراج شده در طول چرخه، در حلال آلي داخل توده10 فيبرتوخالي به دام مي‌افتد. پس از استخراج گونه‌ها طي چرخه‌هاي متوالي، بخشي از حلال آلي موجود در سرنگ براي آناليز به دستگاه كروماتوگرافي تزريق مي‌شود. سيستم سه فازي ديناميك نيز گزارش شده است كه البته مشابه روش دوفازي مي‌باشد. در اين روش، ابتدا ميكروسرنگ با چند ميكروليتر از محلول آبي پذيرنده و به دنبال آن با چند ميكروليتر از حلال آلي پر مي‌شود. مابقي فرايند مشابه روش دو فازي مي‌باشد. HF-LPME ديناميك در مقايسه با سيستم‌هاي استاتيك سرعت استخراج را افزايش مي‌دهد، اما در عمل روش ديناميك پيچيده‌تر است و پارامترهاي تجربي بيشتري بايد كنترل وبهينه شوند (19، 18).
علاوه بر دو سيستم HF-LPMEاشاره شده كه معمولاً براساس گراديان pH و يا انتقال توسط حامل مي‌باشد، اخيراً روش HF-LPMEبا اعمال يك ميدان الكتريكي در دو سمت غشا انجام گرفته و تحت عنوان جداسازي الكتريكي غشا11 نام گرفته است. در اين روش، نيروي محرك براي استخراج گونه‌ها اختلاف پتانسيل است و گراديان pH نقشي در استخراج ندارد (20).
در تحقيقاتي كه توسط Lee انجام گرفت، وي روش جديدي را بر مبناي فيبرتوخالي به نام ميكرواستخراج سه فازي مايع- گاز- مايع12 ابداع نمود. در اين روش گونه‌ها در اثر حرارت از محلول به جداره فيبر پر شده با هوا نفوذ كرده و سپس به دليل pH خاص فاز گيرنده، در شكل يوني خود به درون فاز گيرنده استخراج مي‌شوند. مزيت اين روش اين است كه هيچگونه حلال آلي در آن استفاده نمي‌شود.
2-1-1-2-2.جنبه‌هاي عملي و پيكربندي‌هاي مختلف HF-LPME
تاكنون اغلب كاربردهاي HF-LPMEبراساس فيبرهاي پلي پروپيلن بوده است، ولي استفاده از فيبر متخلخل پلي وينيليدين دي فلوئورايد13 هم گزارش شده است. دليل اين امر، سازگاري بيشتر پلي پروپيلن با گستره وسيعي از حلال‌هاي آلي بوده است. به علاوه، پلي پروپيلن با اندازه‌ي منافذ تقريباً m?2/0به خوبي مي‌تواند حلال‌هاي آلي در فيبر در فرايندLPME تثبيت كند، كه اين موضوع براي جلوگيري از نشت حلال به درون نمونه مهم مي‌باشد. اين مسئله مخصوصاً در مورد محلول‌هايي كه به شدت هم زده مي‌شوند و نمونه‌هايي مانند پلاسما كه با حلال تشكيل امولسيون مي‌دهند، داراي اهميت است. قطردروني فيبرهاي مورد استفاده معمولاً در محدود m?1200-600 مي‌باشد، ولي گزارشاتي نيز در زمينه استفاده از فيبرهاي توخالي با قطر دروني كمتر تا حد m?280 وجود دارد. در گزينش فيبر بايد ضخامت ديواره آن زياد نباشد تا فاصله انتشار در فيبر كوتاه بوده و سرعت استخراج افزايش يابد. فيبرهاي با ضخامت ديواره‌ي خيلي كم استحكام فيزيكي كافي ندارند و در مقابل استفاده از فيبرهاي با ضخامت بيشتر نيز به دليل افزايش حجم و ضخامت لايه‌ي آلي، منجر به زمان‌هاي استخراج طولاني‌تر و كاهش كارايي سيستم مي‌شود. از اين رو معمولاً ضخامت ديواره‌ي m?200براي اين منظور مناسب است. در اكثر موارد از فيبري با جنس پلي پروپيلن با قطر دروني ، m?600ضخامت ديواره‌ي m?200 و اندازه منافذتقريباً m?2/0استفاده مي‌شود (18-12).
در كار عملي با فيبر توخالي پيكربندي‌هاي14 مختلفي از HF-LPMEبه كار مي‌رود. اولين كار در زمينه ميكرواستخراجبا فيبرتوخالي با پيكربندي فيبر به صورت U شكل، توسط Rasmussenو
Pedersen- Bjergaardمعرفي گرديد (12). در اين تحقيق، قطعات 5/8 سانتي‌متر از فيبر توخالي پليپروپيلني با قطر داخلي m?600، ضخامت ديواره‌يm?200و اندازه منافذتقريباً m?2/0براي استخراج بريده و استفاده شده‌اند. هر انتهاي فيبر به يك سوزن ميكروسرنگ متصل شد كه يكي از اين سرنگ‌ها براي ورود فاز گيرنده و ديگري براي كشيدن فاز گيرنده در انتهاي استخراج به كار گرفته شد. براي خروج فاز گيرنده يك فشار فوقاني كوچك روي سوزن اول اعمال مي‌شود و جمع‌آوري فاز گيرنده از لوله خروجي صورت مي‌گيرد. در پيكربندي U شكل كارايي استخراج مناسب است، ولي در مقابل روش انتقال فاز گيرنده و خودكار كردن15 سيستم مشكل مي‌باشد (12). براي رفع اين مشكل، پيكربندي ميله‌اي توسط Rasmussen و Pedersen- Bjergaard و سپس Andrews, Kramer پيشنهاد گرديد (21). شكل (2-4) پيكربندي U شكل و ميله‌اي را نشان مي‌دهد. در پيكربندي ميله‌اي به منظور تسهيل در ورود و خروج ميكروسرنگ، قطعه‌اي مخروطي به نوك فيبر متصل مي‌شودکه امکان ورود و خروج فاز استخراجي را توسط ميكروسرنگ ساده‌تر مي‌سازد. اين تكنيك قابليت سازگاري بيشتري با نمونه‌برداري خودكار دارا مي‌باشد.
5شکل2-4. (الف) سيستم HF- LPME بر اساس پيکربندي (ب) پيکربندي ميلهاي U
به دنبال آن، تكنيك ديگري توسط Muller و همكارانش ارائه شد كه در اين تكنيك به يك انتهاي فيبر وسيله‌اي قيف مانند كه از جنس فولاد زنگ نزن متصل مي‌شود كه محل تزريق است. يك پيچ كوچك در محل تزريق براي نگهداري انتهاي باز فيبر به كار گرفته مي‌شود و تنها از يك ميكروسرنگ براي ورود و خروج فاز گيرنده استفاده مي‌شود. باز بودن بخش انتهايي فيبر، مشكلاتي مانند ايجاد حباب هوا طي كشيدن فاز گيرنده را رفع مي‌كند. در پايان، پس از استخراج يك نمونه‌بردار خودكار مي‌تواند فاز استخراجي را به دستگاه GC تزريق كند.
اخيراً پيكربندي ساده‌تري ارائه گرديده كه شامل اتصال مستقيم فيبر به نوك سوزن ميكروسرنگ مي‌باشد شكل (2-5) در اين تكنيك، طول مشخصي از فيبر پس از بسته شدن انتهاي آن با حرارت، به سوزن ميكروسرنگ كه حاوي محلول استخراجي است، متصل شده و پس از آغشته نمودن جدار فيبر با حلال آلي و تزريق محلول استخراجي به داخل فيبر، محلول استخراج كننده به داخل ميكروسرنگ كشيده و سپس به دستگاه كروماتوگرافي تزريق مي‌شود. شماي اين سيستم در شكل (2-5) نشان داده شده است.
6شکل2-5. طرح شماتيک از سيستم HF- LPME
اين پيكربندي بدون بستن انتهاي فيبر جهت انجام استخراج به صورت ديناميك به كار گرفته شده كه در آن يك پمپ سرنگي به طور خودكار پيستون ميكروسرنگ را بالا و پايين مي‌كشد تا استخراج انجام شود (15). قابل ذكر است كه كاربرد فيبرتوخالي براي استخراج از حجم زيادي از نمونه در حد 1 ليتر و نيز كاربرد آن به صورت نيمه خودكار نيز عملي شده است، به طوري كه در آنها يك يا دو مرحله‌ي استخراج مي‌تواند به صورت خودكار انجام گيرد. شكل (2-6) استخراج از حجم بالاي نمونه و همچنين سيستم نيمه خودكار استخراجي را نشان مي‌دهد.
شکل2-6. (الف) شمايي از سيستم HF- LPME از حجم زياد (ب) سيستم نيمه خودکار
با پيشرفت‌هاي سريع در اين زمينه Pawliszyn و همكارانش در سال 2006 موفق به معرفي سيستم تمام خودكار HF-LPME شدند.
2-1-1-2-3. ميكرواستخراج فاز مايع از فضاي فوقاني با فيبر توخالي
نمونه‌برداري از فضاي فوقاني روش موفقي براي استخراج تركيبات فرار و نيمه فرار از نمونه‌هاي پيچيده است، به طوري كه در آن گونه‌ها ابتدا از نمونه جامد يا مايع خود به فضاي فوقاني نمونه انتقال مي‌يابند، سپس نمونه‌برداري و اندازه‌گيري انجام مي‌گيرد. بديهي است كه گونه‌هايي به اين روش قابل اندازه‌گيري هستند كه فراريت لازم جهت انتقال به فضاي فوقاني را داشته باشند. روش‌هاي نمونه‌برداري از فضاي فوقاني داراي حساسيت كمي هستند، مگر اينكه روش‌هاي مختلف ميكرو استخراج از فضاي فوقاني انجام گيرد. در اين روش‌ها گونه‌هاي خارج شده از بافت نمونه، ابتدا به فضاي فوقاني نمونه وارد و سپس توسط يك فاز استخراجي جذب و تغليظ مي‌شوند. در نهايت گونه‌ها به دستگاه اندازه‌گيري تزريق مي‌شوند. تغليظ انجام شده باعث دستيابي به حساسيت‌هاي بالا شده و اندازه‌گيري مقادير بسيار كم گونه‌هاي مختلف را امكان‌پذير مي‌سازد.
روش‌هاي ميكرواستخراج از فضاي فوقاني به كار رفته تاكنون بر مبناي دو روش فاز جامد و قطره بوده‌اند. در روش ميكرو استخراج با فاز جامد از فضاي فوقاني، نمونه حاوي گونه‌هاي مختلف در ظرف سربسته‌اي قرار داده مي‌شود و از فيبري با پوششها و جاذب‌هاي مختلف براي استخراج و تغليظ نمونه استفاده مي‌شود. پس از گذشت مدت زمان لازم و به تعادل رسيدن سيستم، فيبر جاذب به منظور آناليز به دستگاه‌هاي اندازه‌گيري معرفي مي‌گردد. اين روش داراي معايبي چون، قيمت نسبتاً بالاي فيبرهاي فاز جامد، محدوديت در انواع پوشش فيبرها، محدود بودن طول عمر فيبرها و اثرات حافظه مي‌باشد (24).
اما در روش ميكرو استخراج با قطره، چند ميكروليتر از يك حلال آلي از انتهاي سوزن يك ميكروسرنگ در فضاي فوقاني يك ظرف در بسته حاوي محلول نمونه در حال هم زدن به طور معلق نگهداشته مي‌شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص و انتقال مقداري از آناليت‌ها به فاز آلي، حلال به داخل سرنگ كشيده شده و به سيستم اندازه‌گيري تزريق مي‌شود. اين تكنيك، ساده، سريع، ارزان و بسيار حساس است و تنها با استفاده از يك ميكروسرنگ، مراحل مختلف استخراج، تغليظ و تزريق به سيستم اندازه‌گيري قابل انجام است. علاوه بر اين به دليل عدم تماس مستقيم حلال استخراج كننده با بافت نمونه، مزاحمت‌هاي ناشي از آلودگي حلال استخراج كننده توسط بافت نمونه رفع شده است. از طرفي در اين روش مي‌توان از حلال‌هاي استخراج كننده قابل امتزاج با آب نيز استفاده كرد. از محدوديت‌هاي اين روش تبخير حلال استخراج كننده با گذر زمان مي‌باشد كه مانع از افزايش زمان و استخراج و همچنين دماي محلول مي‌شود كه اين مشكل را مي‌توان با سرد كردن سوزن ميكروسرنگ كه منجر به سرد شدن ميكروقطره مي‌شود تا حدودي رفع كرد. البته اين روش داراي مشكلاتي نظير عدم استفاده از حجم‌هاي بيشتر قطره به دليل افتادن قطره و مساحت سطح كوچك قطره مي‌باشد كه منجر به كاهش كارايي استخراج مي‌گردد. به دنبال تحقيقات صورت گرفته روي HF-LPME كه همگي براساس استخراج مستقيم از محلول نمونه مي‌باشد، Jiang يك روش جديد از آناليز فضاي فوقاني بر مبناي HF-LPME را معرفي كردند.

اين تكنيكمشابه با روش استفاده شدهدرHF-LPMEمي‌باشد، با اين تفاوت كه فيبر توخالي در فضاي فوقاني محلول نمونه قرار مي‌گيرد. بدين ترتيب مزاحمت‌هاي ناشي از بافت پيچيده نمونه برطرف مي‌شود. از طرفي به دليل اينكه فاز استخراجي درون فيبرتوخالي قرار گرفته، مشكل افتادن حلال استخراجي در اينجا رفع شده است و مي‌توان از حجم‌هاي بيشتر نيز استفاده نمود. علاوه بر اين به دليل افزايش مساحت سطح تماس حلال استخراجي و فضاي فوقاني، استخراج‌ها سريع‌تر و با كارايي بيشتري قابل انجام است. همچنين به دليل ارزان بودن فيبرتوخالي، مي‌توان از هر فيبر يكبار براي استخراج استفاده نمود، بنابراين مشكلات اثرات حافظه، موجود در روش فاز جامد، در اين روش وجود نخواهد داشت. از محدوديت اين روش مي‌توان به تبخير و از دست رفتن حلال استخراجي طي فرايند استخراج اشاره كرد، كه اين مشكل نيز با سرد كردن حلال استخراجي قابل رفع است. شماتيك ميكرواستخراج فاز مايع فيبرتوخالي به دو روش مستقيم و فضاي فوقاني در شكل (2-7) نشان داده شده است.
8شکل2-7. طرح شماتيک ميکرو استخراج فاز مايع به روش(الف) مستقيم و (ب) فضاي فوقاني
سيستم ميكرواستخراج از فضاي فوقاني به دو شيوه استاتيك و ديناميك قابل انجام است. در روش ديناميك حلال آلي داخل فيبرتوخالي توسط پمپي كه به پيستون ميكروسرنگ متصل شده است، به طور پي در پي داخل فيبرتوخالي پر و خالي مي‌شود (25).به اين ترتيب حجم معيني از فضاي فوقاني با سرعت مشخص و ثابت به داخل فيبر توخالي كشيده مي‌شود و پس از چند ثانيه توقف، دوباره فاز گازي با فشرده شدن پيستون ميكروسرنگ خارج شده و اين عمل به دفعات معين تكرار مي‌شود. پس از كشيدن حلال به داخل ميكرو سرنگ، سوزن ميكروسرنگ از فيبرتوخالي خارج شده و به دستگاه آناليز تزريق مي‌شود. مكانيسم عمل به اين صورت است كه هنگام بالا كشيدن پيستون ميكروسرنگ، لايه‌اي از حلال كه داخل منافذ فيبرتوخالي است، سطح زيادي را در معرض فاز فوقاني مربوط به فضاي فوقاني محلول نمونه كه به داخل فيبر توخالي کشيده مي‌شود،قرار مي‌دهد.آناليت‌هاي موجود در اين فاز گازي به داخل حلال آلي استخراج مي‌شوند و با کشيدن و فشردن پيستون، هر بار اين فاز گازي تجديد مي‌شود. از طرفي بالا كشيدن حلال آلي به داخل سرنگ، باعث هم زدن و يكنواختي حلال آلي مي‌شود و هنگامي كه حلال دوباره با فشار پيستون به داخل فيبرتوخالي بر مي‌گردد، مثل اين است كه در معرض حلال جديدي قرار گرفته است. زيرا گونه‌هاي جذب شده در سطح حلال آلي در طي اين فرايند به داخل توده حلال استخراجي مي‌روند و غلظت گونه‌ها در حلال استخراجي يكنواخت مي‌شود. اين عمل بارهاانجام مي‌شود تا غلظت مناسبي از گونه‌ها در فاز آلي تجمع و تغليظ گردد. در اين روش كوچك بودن فضاي درون فيبرتوخالي و تعادل سريع بين آناليت‌ها در فاز آلي وآبي باعث كاهش ميزان تبخير حلال آلي مي‌شود. سيستم ديناميك نسبت به حالت استاتيك داراي حساسيت بيشتري است، اما به دليل عدم تكرارپذيري در كشيدن و فشار دادن پيستون ميكروسرنگ، تكرارپذيري روش ديناميك به خوبي استاتيك نيست. البته اخيراً با اتوماسيون سيستم كشيدن و فشار دادن پيستون توسط پمپ‌هاي مناسب، اين مشكل تا حدود زيادي رفع گرديده است.


پاسخ دهید