3-4-2- آنزيم آسپارتات آمينو ترانسفراز بر حسب واحد در ليتر در سرم………………………………………………65
3-4-3- آنزيم آلکالين فسفاتاز بر حسب واحد در ليتر در سرم………………………………………………………………67
3-4-4- آنزيم لاکتات دهيدروژناز بر حسب واحد در ليتر در سرم…………………………………………………………69
3-4-5- ميانگين پروتئين کل بر حسب ميلي گرم در دسي ليتر در سرم…………………………………………….71
3-4-6- ميانگين غلظت آلبومين بر حسب ميلي گرم در دسي ليتر در سرم…………………………………………73
3-4-7- ميانگين غلظت گلوکز بر حسب ميلي گرم در دسي ليتر در سرم……………………………………………75
3-4-8- ميانگين غلظت تري گليسيريد بر حسب ميلي گرم در دسي ليتر در سرم……………………………..77
3-4-9- ميانگين غلظت کلسترول بر حسب ميلي گرم در دسي ليتر در سرم………………………………………79
3-4-10- ميانگين غلظت بيلي روبين کل بر حسب ميلي گرم بر دسي ليتر در سرم……………………………………81
فصل چهارم: بحث و نتيجه گيري
4-1- بحث
4-1-1- بررسي يافتههاي بافتي
4-1-1-1- بررسي رسوب آهن در بافت کبد
4-1-1-2- بررسي يافتههاي هيستوپاتولوژي
4-1-1-3- بررسي مقدار ليپيد پراکسيداسيون در بافت کبد
4-1-1-4- بررسي مقدار آنزيم ها در بافت کبد
4-1-2- بررسي يافته هاي سرمي مربوط به عملکرد کبد
4-1-2-1- بررسي مقادير آنزيم هاي سرم
4-1-2-2- بررسي ميزان عملکردهاي سنتتيک کبد
4-1-2-3- بررسي ميزان عملکردهاي دفعي و ترشحي کبد
4-2- نتيجه گيري
4-3- پيشنهادات براي مطالعات آينده
فصل پنجم: منابع
5-1- منابع انگليسي
فهرست نمودارها
عنوان……………………………………………………………………………………………..صفحه
نمودار 3- 1- مقايسه ميزان رسوب آهن در هپاتوسيتها………………………………………………………………………..49
نمودار 3- 2- مقايسه ميزان آپوپتوز در هپاتوسيتها……………………………………………………………………………….49

نمودار 3- 3- مقايسه ميزان التهاب و تورم در هپاتوسيتها…………………………………………………………………….50
نمودار 3- 4- مقايسه ميزان تغييرات چربي در هپاتوسيتها…………………………………………………………………..50
نمودار 3- 5- مقايسه ميزان اينفيلتراسيون در هپاتوسيتها……………………………………………………………………51
نمودار 3- 6- مقايسه ميزان تغييرات وزن بدن در روزهاي مختلف آزمايش……………………………………………52
نمودار 3- 7- مقايسه مقادير تشکيل کمپلکس مالون دي الدهيد در بافت کبد……………………………………..53
نمودار 3- 8- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم آلانين آمينوترانسفراز در بافت کبد………………………………………55
نمودار 3- 9- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم آسپارتات آمينوترانسفراز در بافت کبد……………………………….57
نمودار 3- 10- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم آلکالين فسفاتاز در بافت کبد…………………………………………….59
نمودار 3- 11- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم لاکتات دهيدروژناز در بافت کبد………………………………………61
نمودار 3- 12- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم آلانين آمينوترانسفراز در سرم……………………………………………63
نمودار 3- 13- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم آسپارتات آمينوترانسفراز در سرم……………………………………..65
نمودار 3- 14- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم آلکالين فسفاتاز در سرم……………………………………………………..67
نمودار 3- 15- مقايسه مقادير فعاليت آنزيم لاکتات دهيدروژناز در سرم………………………………………………..69
نمودار 3- 16- مقايسه مقادير پروتئين کل در سرم………………………………………………………………………………..71
نمودار 3- 17- مقايسه مقادير گلوکز در سرم…………………………………………………………………………………………..73
نمودار 3- 18- مقايسه مقادير کلسترول در سرم……………………………………………………………………………………..75
نمودار 3- 19- مقايسه مقادير تري گليسريد در سرم………………………………………………………………………………77
نمودار 3- 20- مقايسه مقادير آلبومين در سرم……………………………………………………………………………………….79
نمودار 3- 21- مقايسه مقادير بيلي روبين در سرم………………………………………………………………………………….81
فهرست تصاوير
عنوان……………………………………………………………………………………………..صفحه
تصوير 3- 1- بررسي هيستولوژيک کبد (رسوب آهن) در گروههاي مختلف……………………………………………44
تصوير 3- 2- بررسي هيستولوژيک کبد (آپوپتوز هپاتوسيت) در گروههاي مختلف……………………………..45
تصوير 3- 3- بررسي هيستولوژيک کبد (تورم) در گروههاي مختلف………………………………………………………..46
تصوير 3- 4- بررسي هيستولوژيک کبد (تغييرات چربي) در گروههاي مختلف………………………………………47
تصوير 3- 5- بررسي هيستولوژيک کبد (اينفيلتراسيون سلولهاي التهابي) در گروههاي مختلف……………48
فهرست شکلها
عنوان……………………………………………………………………………………………………………..صفحه
شکل 1- 1- هيستولوژي کبد………………………………………………………………………………………………………………………5
فصل اول
مقدمه
مقدمه و اهداف
بر اساس مطالعاتي که تا کنون صورت گرفته، مشخص شده که يکي از علل نارسايي حاد کبدي مي تواند مصرف مقادير زياد آهن باشد که اغلب در کودکان زير 6 سال و زنان باردار ديده مي شود (Albertsen, 2006). آهن يکي از مهمترين عناصر موجود در بدن است که در هموگلوبين، ميوگلوبين، سيتوکرومها و آنزيمهاي وابسته به آهن يافت ميشود. آهن توسط سلول ها به حالت تعادل بين سطح ضروري و سطح سمي آن حفظ مي شود، در بعضي موقعيتها اين تعادل به هم ريخته و باعث اضافه بار آهن1 مي شود .( Sarkar et al., 2012) اضافه بار آهن ميتواند سبب آسيب هاي مخربي به لوله گوارش شده، به زخم معده، خونريزي و شوک منجر گردد. آهن همچنين موجب افزايش نفوذپذيري مويرگها، اتساع آرتريولها و اسيدوز شديد مي گردد. مکانيسم سلولي که توسط آن اضافه آهن منجر به سميت ميگردد شامل تشکيل راديکالهاي آزاد مثل راديکال هيدروکسيل (·OH) طي واکنش فنتون و پس از آن شروع پراکسيداسيون ليپيدهاي غشاي اندامکها، اکسيداسيون پروتئين ها و نوکلئيک اسيد است .(Zhang et al., 2006)پراکسيداسيون ليپيدها ميتواند به تغييرات ساختاري و عملکردي در ليزوزومها، ميتوکندري و شبکه اندوپلاسمي گردد. آسيبهاي اکسيداتيو به غشاي سلول و اندامکهايش ميتواند کاهش قابل توجه در عمر سلولها را منجر شود (Allameh et al., 2008). راديکالهاي آزاد اکسيژن ناشي از مصرف بيش از حد آهن ممکن است نکروز کبدي را ايجاد ميکنند که ابتدا نارسايي حاد کبدي و پس از آن نارسايي چندين اندام ديگر را به دنبال دارد(Sharma et al., 2011) . مطالعات نشان داده اند که سولفات آهن در شرايطي که بيش از حد معمول مصرف گردد، باعث سميت کبدي ميگردد که با نشت آنزيمهاي کبدي هم در سرم و هم در بافت کبد و نيز افزايش ميزان بيليروبين در سطح سرم همراه است در حاليکه سطح پروتئينهاي سرمي مثل آلبومين کاهش پيدا مي کند. همچنين، مطالعات هيستولوژيک کبد حاکي از نکروز شدن هپاتوسيتها، تغييرات چربي و التهاب پورتال هستند ((Pawar et al., 2012. بيماري هاي کبدي با مرگ و مير زيادي همراه هستند، داروها و درمان هاي معمول تنها حدود 1? درصد از بيماران مبتلا را از مرگ نجات مي دهد؛ همين موضوع سبب شده است تا برخي از دانشمندان علوم دارو شناسي پتانسيل فعاليت حفاظت کبدي را در گياهان و بر پايه طب سنتي جستجو کنند (Selvi, 2012).
براي حفاظت از سلول هاي کبدي از داروهاي شيميايي گوناگوني بهره گرفته ميشود. اين داروها عملکرد کبد را تحت تاًثير قرار ميدهند اما استفاده از ترکيباتي آنتي اکسيدان و نيز گياهان حاوي ترکيبات فنوليکي همچون کوئرستين، مفيد بوده و اثر حفاظتي و بهبودي بخش خود را بدون اثرات جانبي ميتوانند اعمال کنند (Satyendra et al, 2012).
فلاونوييدها2 متعلق به يک گروه از مواد طبيعي با ساختارهايي فنوليکي هستند که توزيع وسيعي در شاخه گياهان دارند(Padma et al., 2012) . از ميان بيوفلاونوييدهاي آزمايش شده کوئرستين3 بالاترين خاصيت آنتي اکسيداني را نشان داده است (Satyendra et al., 2012). کوئرستين با نام علمي 3،3،?،?،3،?-پنتاهيدروکسيل فلاوون4 يکي از برجسته ترين آنتي اکسيدان هاي رژيمغذايي است که در شکل گليکوزيله خود در لوبياي سبز، کلم بروکلي، سيب، و مخصوصاً در پياز يافت مي شودHamed et al., 2012) ). گزارش شدهاست که کوئرستين داراي اثرات سودمند در سلامتي انسان است مثل حفاظت قلبي عروقي، فعاليت ضد سرطاني، فعاليت ضد ويروسي و ضد باکتريايي، و اثرات ضدالتهابي که اين اثرات منجر به فعاليت و خواص آنتياکسيداني قوي آن مي شود Satyendra et al., 2012)) .همچنين مشخص شده است که کوئرستين داراي اثرات درماني در برابر بيماري هاي متعددي از قبيل نارسايي قلبي، آترواسکلروز، فيبروز کبدي، آسيب کليوي، و جلوگيري از آسيب مزمن صفراوي استDavid et al., 2011) ). همچنين کوئرستين داراي اثرات سودمندي در سرکوب تکثير سلول، حفاظت از اکسيداسيون ليپيدها و جلوگيري از تجمع پلاکتي مي باشد Mishra et al., 2013)) .
از آنجايي که فلاونوئيدها مهارکننده هاي مؤثري در ليپيدپراکسيداسيون و کي ليت کردن آهن هستندGao et al., 1999) )، بنابراين جاي تعجب نيست که فلاونوئيدها مي توانند مهارکننده هاي خوبي براي فيبروز در بيماري اضافه بار آهن باشند. پس به طور خلاصه مي توان گفت که مکمل هاي فلاونوييدي با هردو فعاليت آنتي اکسيداني و کي ليت کردن آهن مي تواند دفع آهن را در اضافه بار آهن در کبد موش افزايش داده و بنابراين کبد را ازاسترس اکسيداتيو و فيبروز حمايت کنند .(Zhang et al., 2006)
با توجه به مطالعات صورت گرفته مشخص شده است که کوئرستين داراي خواص ضدالتهابي، آنتي اکسيداني و کي ليت کردن فلزات است؛ ولي تا کنون گزارشي مبني بر بررسي اثر محافظتي آن در برابر اضافه بار سولفات آهن و تاثير آن در نارسايي حاد کبدي و اختلالات عملکردي و بافتي کبد منتشر نگرديده است، از اينرو در اين پژوهش اين موضوع مورد بررسي و تحليل قرار مي گيرد.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-2- کبد
1-2-1 – هيستولوژي کبد
کبد يکي از مهمترين اندامهاي بدن است که البته بزرگترين غده هم به شمار ميرود. اين اندام چند لوبه و بزرگ است که در حفره شکم واقع شده و اعمالش در ارتباط نزديکي با سيستم گوارشي است. (Guyton and Hall, 2006). اين اندام 20% از خون خود را از شريان کبدي و80% مابقي را از وريد باب دريافت مي کند. کبد توسط بافت همبند احاطه شده است و واحد اصلي عملکردي اين اندام لوبول ها هستند که حول يک وريد مرکزي سازمان مي يابند (Berne and Levy, 2008).
شکل 1-1- هيستولوژي کبد
هپاتوسيت ها يا سلول هاي پارانشيم کبدي جز ساختاري اصلي کبد هستند که 60% از کل سلول ها را تشکيل مي دهند. آنها در هر لوبول به شکل شعاعي آرايش يافته اند و صفحات سلولي بين سينوزوئيدها (مويرگ هاي اختصاصي کبد) را تشکيل مي دهند. خون از طريق انشعابات وريد باب و شريان کبدي به کبد وارد شده و پس از عبور از سينوزوئيدها به وريد مرکزي تخليه مي گردد (Vekemans and Braet, 2005). سينوزوئيدها عروق گشاد و نامنظمي هستند که از يک لايه سلول هاي اندوتليال منفذدار منقطع تشکيل شده اند. زير اندوتليوم سينوزوئيدي و اندوتليوم جدا کننده هپاتوسيت ها يک لايه نازک از بافت ارتباطي شل به نام فضاي ديس وجود دارد که سلول هاي ستاره اي کبد در آن قرار گرفته اند (Berne and Levy, 2008).
1-2-2- عملکرد کبد
کبد مکان اصلي براي سوخت و ساز و دفع مواد زايد است و با تمام مسيرهاي بيوشيميايي رشد، مبارزه عليه بيماريها، توليد مواد مغذي، فراهم کردن انرژي و توليد مثل درگير است (David et al., 2011). اعمال پنج گانه کبد عبارتند از: 1) کمک به متابوليسم کل بدن شامل متابوليسم کربوهيدرات ها، پروتئين ها، چربي ها، هورمون ها، و مواد شيميايي خارجي ?) سميت زدايي، فيلتراسيون و ذخيره کردن خون 3) دفع مواد زايد محلول در ليپيد يا متصل به پروتئين ?) ساخت پروتئينها، صفرا و عوامل انعقادي ?) ذخيره ويتامين ها و آهنBerne and Levy, 2008) Guyton; and Hall,2006). اين اندام هدف اصلي براي سميت با آهن است به دليل اينکه کبد عمدتاً مسئول برداشت و ذخيره مقادير بيش از اندازه آهن است. تجمع بيش از حد آهن در کبد منجر به آسيبهاي متعددي ازجمله نکروز سلولهاي کبدي، التهاب، فيبروز و حتي سرطان مي گردد (Zhang et al., 2006).
1-2-2-?- ارزيابي عملکرد کبد
بيماري هاي کبدي اغلب با اختلالات بيوشيميايي سيستم هاي مختلف کبدي يا عملکرد کبد منعکس مي شوند. تست هايي که سطح آنزيم هاي سروم کبدي را اندازه مي گيرند، به عنوان تست هاي عملکرد کبدي نشان داده مي شوند و شامل آلانين ترانس آميناز (ALT)، آسپارتات ترانس آميناز (AST)، آلکالين فسفاتاز(ALP) ، گاماگلوتاميل ترانسفراز(GGT) ، زمان پروترومبين و آلبومين سرم هستند که آنها منعکس کننده عملکردهاي مختلف کبدي مي باشند (Giboney et al., 2005).
1-2-2-2- آمينوترانسفرازهاي AST و ALT
ALT و AST قابل اطمينان ترين مارکرها براي آسيب کبدي و نکروز به حساب مي آيند (Giannini et al., 2005). آمينوترانسفرازهاي AST و ALTبا غلظت بالايي در کبد متمرکز هستند. سطح هردوي اين آنزيم ها پس از آسيب هپاتوسيت ها، نکروز مرتبط با داروها، توکسين ها، ايسکمي و هپاتيت شديداً بالا ميرود (Giboney et al., 2005). AST علاوه بر سيتوزول در ميتوکندري سلولهاي کبدي و همچنين بافت هاي ديگر بدن از جمله قلب، ماهيچه اسکلتي، کليه ها، مغز و گلبول هاي قرمز خون حضور دارد (Giannini et al., 2005). در حاليکه مقدار عمده ALT به طور طبيعي در کبد يافت مي شود با اين وجود در ديگر بافت هاي بدن از جمله کليه ها و ماهيچه هاي اسکلتي هم يافت شده است (Giannini et al., 2005). بنابراين از آنجايي که در کبد ALT منحصراً در سيتوپلاسم سلول هاي کبدي است و غلظت آن در بافت هاي ديگر کم است، اينگونه انتظار مي رود که افزايش سطح سرمي ALT براي آسيب کبدي اختصاصي تر باشد (Giboney et al., 2005).
1-?-?-3- آلکالين فسفاتاز (ALP)
بيماري هاي کبدي و استخواني شايعترين علل پاتولوژيکي بالا رفتن سطح اين آنزيم مي باشند. ALP عمدتاً از دو منبع سرچشمه مي گيرد: مغز استخوان و کبد. اين آنزيم ممکن است از بافت هاي ديگري همچون جفت، کليه ها يا روده ها و يا از لکوسيت ها نشاَت بگيرد. اين آنزيم مارکر غشاي پلاسمايي و شبکه اندوپلاسمي به حساب مي آيد و اغلب براي بررسي يکپارچگي غشاي پلاسمايي مورد ارزيابي قرار مي گيرد (Giboney et al., 2005).
1-?-?-?- لاکتات دهيدروژناز(LDH)
اين آنزيم تقريباً در اکثر بافت هاي بدن حضور دارد و داراي پنج ايزوآنزيم مختلف مي باشد (George et al., 1997). ايزو آنزيم هاي 1و? در بافت هاي قلب، کليه، و گلبول هاي قرمز خون هستند در حاليکه ايزوآنزيم 3 در بافت لنفاوي، ريه ها و پلاکت ها و بالاخره ايزوآنزيم هاي ?و? در کبد حضور دارند (Faddah et al., 2007). وجود اين آنزيم در سرم آسيب هپاتوسيت ها را مشخص مي کند ، ليکن اين آنزيم براي آسيب هپاتوسيت ها و نکروز آنها نسبت به آمينوترانسفرازها کمتر اختصاصي مي باشد (Giannini et al.,2005). از آنجايي که ايزوآنزيم LDH در اندام ها و بافت هاي مختلف متفاوت است آناليز آن در سرم در تعيين محل آسيب ديده سلولي مفيد مي باشد (George et al., 1997).
1-3- نارسايي حاد کبدي
1-3-1-تعريف
نارسايي حاد کبدي5 به القاء آسيب يا التهاب در بافت کبد منجرشده و يا با از بين رفتن سريع عملکرد سلول هاي کبد همراه مي شود (Polson and Lee, 2005). نارسايي حاد کبدي که از نشانههاي تشخيص آن Coagulopathy و Hepatic encephalopathy است، با نکروز حاد تعداد زيادي از هپاتوسيتها و يا به دنبال آسيب شديد عملکرد هپاتوسيتها به طور کاملاً ناگهاني ايجاد ميشود (.(Stravitz and Kramer, 2009 در اين حالت عملکردهاي کبد مثل گلوکونئوژنز، توليد فاکتورهاي انعقادي، عملکردهاي دفعي کبد (ترشح صفراوي بيليروبين و اسيدهاي صفراوي) و عملکردهاي متابوليکي آن (متابوليسم اوره) دچار اختلال ميشوند (Gotthardt et al., 2007).
1-3-2- اتيولوژي
هپاتيت هاي ويروسي شايعترين علت قابل شناسايي نارسايي حاد کبد ((ALF در سراسر دنيا هستند. از ديگر علل شايع براي القاء نارسايي حاد کبدي را مي توان عفونتها (هپاتوويروسها)، توکسينها (سم ليندان)، موادشيميايي (تيواستاميد، کلروکوين، فنوالريت و تتراکلريدکربن)، داروها (استامينوفن، سولفات آهن)، ايسکمي، هيپوکسي کبدي، مصرف الکل ، مواد مخدر ، اختلالات متابوليکي و اختلالات قلب عروقي را نام برد Polson and Lee, 2005)). داروهاي مختلف هم از جمله دارو هاي ضد تشنج، عوامل ضد قارچي، عوامل ضد سل، هالوتان ها و کورتيکواستروئيدها، داروهاي ضد التهابي غيراستروئيدي، بيماري ويلسون6 و سندرم ري7 هم منجر به نارسايي حاد کبدي مي شوند (Gotthardt et al., 2007).
1-3-3- پاتوفيزيولوژي نارسايي حاد کبدي
به طور کلي نارسايي حاد کبدي با کاهش سنتز پارامترهاي کبدي (اختلال شديد در عملکرد سنتتيک کبد) و کاهش سم زدايي که منجر به درجات مختلفي از انسفالوپاتي مي شود، همراه است (Gotthardt et al., 2007). آسيب به هپاتوسيت ها، منجر به آسيب سلول يا مرگ سلول از طريق نکروز و آپوپتوز ميشود (Rutherford and Chung, 2008). آسيب نکروزي سلول هاي کبدي هم به نوبه خود منجر به از دست رفتن يکپارچگي و تماميت ساختاري غشاي پلاسمايي و پارگي احتمالي آن و مرگ سلول با رهايش پروتئين هاي سيتوزولي از جمله لاکتات دهيدروژناز، آلانين آمينو ترانسفراز، آسپارتات آمينوترانسفراز، و فريتين شود (Smilkstein et al., 1988). که همگي منجر به افزايش حساسيت سلولي به آسيب هاي اکسيداتيو و اختلال در توانايي کبد در سم زدايي برخي از مواد سمي مي شود؛ ساير مکانيسم هاي سم زدايي هم دچار اختلال مي شوند: از جمله سيستم هاي حمل و نقل بيلي روبين که منجر به کلستاز8 و هيپربيلي روبينمياا9 مي گردند (Schilsky et al., 2009). يکي ديگر از ويژگي هاي مهم آسيب حاد و مزمن کبدي از دست رفتن کلي عملکرد کوپفر سل هاست که منجر به کاهش کليرانس اندوتوکسين ها و ديگر موادي مي شود که به طور منظم و مکرر توسط گردش خون به کبد وارد ميشوند Hawker, 1997)).
1-3-?- پاسخهاي التهابي کبد در ALF:
ماکروفاژهاي مستقر در کبد يا کوپفرسلها نقش بارزي در فاگوسيتوز و ايمني بازي ميکنند. کوپفر سلها منبع اصلي پاسخهاي التهابي در کبد ميباشند و به محض تحريک، سيتوکينهاي پيش التهابي مانند IL-6 و IL-1? را توليد ميکنند (Colletti et al., 1996). در پاسخ به قرار گرفتن در معرض واسطههاي التهابي وابسته به فعال شدن کوپفرسلها، هم سلولهاي اندوتليال و هم لکوسيتها فعال ميشوند و لکوسيتها درون بافت کبدي تجمع پيدا ميکنند و منجر به افزايش ميزان التهاب و فاز ثانويه آسيب کبد ميشوند (Vollmar and Menger., 2009).
واسطههاي التهابي که منجر به تجمع لکوسيتها درون عروق کبدي ميشوند عبارتند از: TNF-?، IL-8، IL-1?، فاکتورهاي فعال کمپلمان و کموکاينهاي CXC (Colletti et al., 1996). اين واسطههاي التهابي بيان لکوسيتي مولکولهاي CD11b/CD18 (اعضاي خانواده -2? اينتگرين پروتئينهاي چسبنده) را افزايش ميدهند و همچنين القاي E-سلکتين، P-سلکتين و مولکول چسبنده داخل سلولي 10ICAM-1 را روي اندوتليوم موجب ميشوند، که باعث تجمع بيشتر لکوسيتها و در نهايت اختلال در خونرساني به هپاتوسيتها و مرگ آنها ميگردد. فعال شدن و تجمع لکوسيتها يک مکانيسم دفاعي به حساب ميآيد (Vollmar and Menger., 2009).
1-?- منابع آهن در بدن
علاوه بر هموگلوبين خون، کبد بزرگترين منبع آهن به حساب ميآيد. اين آهن به شکل فريتين در کبد يافت ميشود. در هپاتوسيتهاي کبدي ميزان قابل توجهي از مولکول پروتئيني آپوفريتين وجود دارد که ميتواند به طور برگشتپذير با آهن ترکيب شود. بنابراين زماني که غلظت آهن در مايعات بدن بالا رود با اين مولکول ترکيب شده و فريتين را ميسازد وتا وقتي که در نقطهاي از بدن به آن نياز نباشد از اين مولکول آزاد نميشود. از اينرو سيستم آپوفريتين-فريتين به عنوان بافر آهن خون و همچنين ذخيره کننده آهن عمل ميکند (Guyton and hall, 2006).
1-?-1- نقش آهن در ايجاد آسيب کبدي:
آهن يکي از مهمترين عناصر موجود در بدن است که در هموگلوبين، ميوگلوبين، سيتوکرومها و آنزيمهاي وابسته به آهن يافت ميشود و در فرآيندهاي سلولي و بيولوژيکي از قبيل سنتز هموگلوبين، حمل و نقل الکترون، سنتز DNA و همچنين رشد و تکثير سلولها شرکت ميکند. اگرچه يک سطح بهينه از آهن توسط سلول ها به حالت تعادل بين سطح ضروري و سطح سمي آن حفظ مي شود، در بعضي موقعيتها اين تعادل به هم ريخته و باعث اضافه بار آهن11 و سميت کبدي مي شود (Zhang et al., 2006). در شرايط پاتولوژيکي يا مرحله سميت، اضافه بار آهن بافتهاي مختلفي مخصوصاً کبد را تحت تأثير قرار ميدهد (Najafzadeh et al., 2010). از آنجايي که کبد محل اصلي ذخيره آهن به شمار ميرود (2008Allameh et al., )، پيشنهاد شده است که غلظت خفيف تا متوسط آهن کبدي ممکن است آسيب کبدي را تشديد کرده و پيشرفت فيبروز کبدي را تسريع ببخشد (Arezzini et al., 2003).
سميت با آهن به توليد راديکالهاي آزاد برميگردد (McCord 1998). هم در شرايط نرمال و هم در شرايط پاتولوژيکي آنيون سوپراکسيد (O_2^-) و هيدروژن پراکسيد (H2O2) توليد ميگردد که توسط آنزيمهاي آنتياکسيداني بدن مثل سوپراکسيد ديسموتاز، گلوتاتيون پراکسيداز و کاتالاز متابوليزه شده و اين راديکالهاي آزاد را خنثي ميکنند (Najafzadeh et al., 2010). يکي از اثرات آنيون سوپراکسيد، رهايش آهن ذخيره شده از فريتين است. در حالت مصرف بيش از حد آهن، يونهاي آزاد آهن با O_2^- و H2O2 طي واکنش فنتون12 واکنش داده و راديکالهاي سميتر و واکنشپذيرتر هيدروکسيل (OH^•) را ايجاد ميکنند.
Fenton reaction:
اين راديکال سمي هم به نوبه خود باعث دپليمريزه کردن پليساکاريدها، شکستن رشتههاي DNA، غيرفعال کردن آنزيمها و شروع پراکسيداسيون ليپيدها ميشود که به نوبه خود منجر به تخريب غشاهاي سولي و غشاهاي اندامکهاي سلولي مثل ميتوکندري و ليزوزوم ميشود. به عنوان مثال با تخريب غشاي ليزوزوم آنزيمهاي پروتئوليتيک آزاد شده و آسيبهاي بيشتري را به سلول اعمال ميکنند و ممکن است مرگ سلول را موجب شوند (Hershko et al., 1998). آسيب با آهن مي تواند با نشت آنزيمهايي مثل آلانين آمينوترانسفراز ALT))، آسپارتات امينوترانسفراز AST)) ولاکتات دي هيدروژناز (LDH) مورد ارزيابي قرار بگيرد Reddy et al., 1995)).
1-?-?- نارسايي حاد کبدي القاء شده توسط سولفات آهن:
سولفات آهن ارزانترين، سمي ترين وغالب ترين منبع استفاده آهن است که تقريبا 20% آن را عنصر آهن تشکيل مي دهد. بروز علايم سميت با آن ابتدا از لوله گوارش (با استفراغ خون به رنگ روشن) و اسهال شروع مي شود و سپس با لکوسيتوز13 و اختلال در تنفس و حس همراه است که در نهايت به اسيدوز متابوليک و اغماء خاتمه مييابدAlbresten, 2006) ) .سولفات آهن با تجمع در سلولهاي کوپفر و هپاتوسيتها همراه بوده و باعث برهم زدن ترتيب و آرايش هپاتوسيتها، هيپرتروفي در سلولهاي کبدي و کاهش فضاي سينوزوئيدي ميشود .(Selvi., 2012; Padma et al., 2010)
1-?- فلاونوئيدها
گياهان با ترکيبات فنوليکي از قبيل فلاونوييدها14 يک نقش مهم در درمان تعدادي از بيماريها داشته و برخي از آنها يک اثر حفاظت کبدي قوي دارند Sharma et al., 2011)). فلاونوييدها داراي يک ساختار بنزوپيرن مشترک اند و آنها بر اساس ساختار سطحي به دليل وجود يک پيوند دوگانه در مرکز حلقه آروماتيک و همچنين براساس ميزان اشباع شدگي و شکافتگي حلقه مرکزي پيران عمدتاً به فلاون، فلاونول، ايزوفلاونول، فلاوانون، وفلاوانونولز دسته بندي ميشوند (Padma et al., 2012; Hamed et al.,2011).
1-5-1- کوئرستين:
از ميان بيوفلاونوييدهاي آزمايش شده کوئرستين15 بالاترين خاصيت آنتي اکسيداني را نشان دادهاست. کوئرستين با نام علمي 3,3,5,4 ,7-penta hydroxyl flavon)) يکي از برجسته ترين آنتي اکسيدان هاي پلي فنوليک رژيمغذايي است که در شکل گليکوزيله خود در لوبياي سبز، کلم بروکلي، سيب، و مخصوصاً در پياز يافت مي شودHamed et al., 2012) ). شهرت اين فلاونوئيد به عنوان يک آنتي اکسيدان، از واکنش ترکيبات فنولي با گونه هاي راديکال آزاد براي تشکيل راديکال هاي فنوکسي که کمتر واکنش پذير اند ريشه مي گيرد(Padma et al., 2010).
1-?-?- اثرات حفاظتي کوئرستين بر کبد
اثرات سودبخش کوئرستين در نمونه هاي مختلفي از استرساکسيداتيو يافت شدهاست. کوئرستين از طريق بازگرداندن سطوح تغييريافته ليپيدها به حالت طبيعي، اثر حفاظتي در برابر تغييرات سطح ليپيدهاي سرم و آسيب کبدي القاء شده با سم ليندان در رتهاي ويستار اعمال مي کند .( Padma et al., 2012)
مطالعات بر روي کبد موش صحرايي نشان داده اند که کوئرستين داراي اثرات آنتياکسيداني بر عليه آسيبهاي استرس اکسيداتيو القاء شده با تيواستاميد16 و کلروکوين17 (Mishra et al., 2013) و فنوالريت18 (Waheed et al., 2012) بوده و سطح آنتي اکسيدانهاي کبد را بالا مي برد. کوئرستين به عنوان يک فلز کيلاتور بسيار عالي شناخته شده است و ثابت شده که از طريق برهم کنش با متابوليت فعال و واکنشگر NAPQ1 حاصل از متابوليسم پاراستامول که به زنجيره تنفسي ميتوکندري آسيب ميرساند، از کاهش مصرف اکسيژن در زنجيره تنفسي ميتوکندري جلوگيري به عمل آورده در نتيجه تنفس سلولي بعد از به کارگيري کوئرستين افزايش پيدا خواهد کرد، بنابراين از نکروزه شدن سلول ها جلوگيري به عمل مي آورد (Guzy et al., 2004). IL-10يک سيتوکين ضدالتهابي قوي است که سنتز چندين واسطه پيش التهابي را کنترل مي کند (Moore et al., 2001). گزارش ها حاکي از آن است که کوئرستين باعث جلوگيري از کاهش سطح سرمي آن در طي مصرف بيش از حد اتانول شده که مسئول عمل ضدالتهابي و کاهش آسيب در بافت کبد استChen 2010) ). همچنين کوئرستين منجر به پايين آوردن سطوح افزايش يافته سيتوکين هاي التهابي مثل IL-1?، IL-6 و IL-8 درسرم رت هاي مبتلا به بيماري کبد الکلي مي شود (Chen 2010).
در سنتز اسيدهاي چرب 19SREBP?1c و FAS20 نقش دارند؛ ثابت شده است که کوئرستين بيان FAS و SREBP-1c را مهار کرده و با اين کار از اثري که اين پروتئين ها بر روي سنتز آنزيم هاي درگير در بيوسنتز اسيدهاي چرب در حالت بيماري کبد چرب غير الکلي مي گذارند ممانعت به عمل مي آورد (Li et al., 2012). کوئرستين باعث سرکوب رهايش فاکتور هسته اي NF-?B با ممانعت از تخريب I?B? (کمپلکس پروتئيني مهار کننده NF-?B) مي شود و در اين صورت از اثري که اين فاکتور بعد از ورودش به هسته و فعال کردن ژن هاي مسئول توليد فاکتور هاي دخيل در پاسخ هاي التهابي سلول مي گذارد، ممانعت به عمل مي آورد (Evans et al., 2002; Cho., 2003). فاکتور NF-?B از جمله مسيرهاي سيگنالينگ حساس به استرس است که در شرايطي مثل افزايش توليد ROSو القاي استرس اکسيداتيو در حالت مقاومت به انسولين و ديابت فعال مي شود (Horton et al., 1998).
فصل دوم

مواد و روش ها
اين تحقيق روي 35 سر موش صحرايي نژاد ويستار با وزن 300-250 گرم انجام شد. در ابتداي آزمايش موش هاي صحرايي در شرايط °c24-22 و سيکل روشنايي خاموشي 12 ساعت (هفت صبح تا 7 شب روشن و 7 شب تا 7 صبح تاريک) نگهداري مي شدند. به جز در شرايط آزمايش، آب و غذا بصورت آزاد در اختيار آنها قرار مي گرفت.
?-?- مواد مورد نياز:
– موش صحرايي نر بالغ
– خوراک موش صحرايي
– آب مقطر
– پنبه و گاز
– کتامين و زايلازين
– تيوباربيتوريک اسيد
– تري استو استيک اسيد
– نيتروژن مايع
– فرمالين 10%
– کيت سنجش ALT، AST، ALP وLDH
– کيت سنجش بيلي روبين، آلبومين، گلوکز، کلسترول و تري گليسيريد
– هماتوکسيلين
-ائوزين
-پارافين
– چسب انتلان
– کوئرستين
– سولفات آهن
?-?- وسايل مورد نياز:
– ميز جراحي
– وسايل جراحي (انواع قيچي و پنس)
– حمام آب
– PH متر
– ترازوي ديجيتال با دقت صدم گرم
– ترازوي مخصوص توزين موش
– ميکروپيپت
– تانک ازت
– فريزر 80- درجه سانتيگراد (آزمايشگاه مرکزي)
– دستگاه ميکروسانتريفيوژ (آزمايشگاه مرکزي)
– دستگاه اسپکتروفتومتر(آزمايشگاه مرکزي)
– ميکروسکوپ نوري
– ميکروسکوپ مجهز به دوربين عکاسي (اطاق تجهيزات ميکروسکوپي)
– نيدل گاواژ مخصوص موش صحرايي
– يخچال فريزر
– انکوباتور (آزمايشگاه تکوين)
– ميکروتوم دوار (آزمايشگاه تکوين)
– سرنگ خونگيري
– اپندروف
– کرايوتيوب
– سرسمپلر
– جار رنگ آميزي
– لام و لامل
– دستگاه هموژنايزر (آزمايشگاه مرکزي)
?-3- گروه هاي آزمايشي
پنج گروه از موشها مورد آزمايش قرار گرفتند (n=7) :
گروه شاهد (Sham): در اين گروه تمامي مراحل آزمايش مطابق با پروتکل آزمايش انجام شد و به مدت 14 روز (روزي يک بار) يک ميلي ليتر آب مقطر به صورت گاواژ به حيوانات داده شد.
گروه دريافت کننده حلال Sham+DMSO)): در اين گروه تمام شرايط همانند گروه شاهد است با اين تفاوت که تزريق درون صفاقي حلال کوئرستين (دي متيل سولفوکسيد) به ميزان يک ميلي ليتر، به مدت 14 روز (روزي يک بار) دريافت شد.
گروه دريافت کننده کوئرستين (Sham+Q): در اين گروه تزريق درون صفاقي کوئرستين به ميزان 50 ميلي گرم به ازاء هر کيلو گرم وزن بدن در يک ميلي ليتر حلال (دي متيل سولفوکسيد) به مدت 14 روز (روزي يک بار) صورت گرفت.
گروه دريافت کننده سولفات آهن (FS): در اين گروه تمامي مراحل آزمايش مطابق با پروتکل آزمايش انجام گرفت و به مدت 14روز (روزي يک بار) تزريق درون صفاقي 30 ميلي گرم به ازاء هر کيلو گرم وزن بدن سولفات آهن در يک ميلي ليتر آب مقطر به حيوانات داده شد.
گروه دريافت کننده سولفات آهن + کوئرستين (FS+Q): در اين گروه تمامي مراحل آزمايش مطابق با پروتکل آزمايش انجام شد و به مدت 14 روز (روزي يک بار) تزريق درون صفاقي 30 ميلي گرم به ازاء هر کيلو گرم وزن بدن سولفات آهن در يک ميلي ليتر آب مقطر به حيوانات صورت گرفت. در اين گروه از روز چهارم تزريق درون صفاقي کوئرستين به ميزان 50 ميلي گرم به ازاء هر کيلو گرم وزن بدن در يک ميلي ليتر حلال (دي متيل سولفوکسيد) به مدت 11 روز (روزي يک بار) انجام شد.
?-?- روش آماده سازي حيوانات
بعد از اتمام 14 روز حيوانات با کتامين-زايلازين بيهوش شدند و پس از ثابت کردن آن ها بر روي ميز جراحي، يک برش طولي بر روي شکم آن ها ايجاد مي شد و با باز شدن آن، نمونههاي خون از بطن قلبشان با استفاده از سرنگ گرفته شد و پس از گذشت چند دقيقه، سرم خون توسط دستگاه سانتريفيوژ مدل () جدا سازي و جهت اندازهگيري پارامترهاي مختلف در دماي 20- درجه سانتي گراد، نگهداري شد. در پايان بافت کبد حيوان جدا و توزين شد. به منظور اندازه گيري ميزان ليپيد پراکسيداسيون و سنجش آنزيمهاي موجود در بافت کبد سريعاً بخش هاي مشخصي از کبد بر روي يخ خشک جدا شده و در نيتروژن مايع در دماي ?80- نگهداري شد. سپس بخش مشخصي از کبد جهت مطالعات هيستوپاتولوژي جدا و در فرمالين 10% تثبيت گرديد.
?-?- سنجش ميزان فعاليت آنزيمهاي ALT، AST، ALP و LDH در سرم و بافت کبد:
تعيين ميزان فعاليت آنزيمهاي ALT، AST، ALP و LDH موجود در سرم و بافت کبد، با استفاده از کيت سنجش آنزيم ساخت شرکت پارس آزمون انجام گرفت.
به منظور آمادهسازي بافت براي اندازهگيري آنزيم، ابتدا بافت مورد نظر در يک ميلي ليتر از بافر سيترات با PH= 4/8 هموژنه گرديد. پس از سانتريفيوژ نمودن نمونه، محلول فوقاني موجود در اپندورف جهت سنجش فعاليت آنزيمها مورد استفاده قرار گرفت. در نمونه هاي خوني نيز، فعاليت آنزيم ها در سروم خون سنجش و اندازه گيري شدند.
نحوه تهيه محلول بافر سيترات با PH=4/8
استاک A (0/1 M سيترات سديم با MW=294/10)
استاک B (0/1 M اسيد کلريدريک با MW= 36/46)
بافر سيترات با PH=4/8: با مخلوط کردن 1 ميلي ليتر استاک A و 2/9 ميلي ليتر استاک B، تهيه ميشود.
?-?-1- اندازه گيري آنزيمها بر اساس کيت:
براي اندازهگيري، از روش دومحلوله استفاده شد. در اين روش، ميزان مشخصي از نمونه با معرف شماره يک مخلوط شد. پس از 5 دقيقه انکوبه شدن در دماي ?37 معرف شماره دو اضافه گرديد. در نهايت پس از مخلوط شدن نمونه با معرف هاي يک و دو، مقدار جذب نوري در دقايق 1، 2 و 3 با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدلDTS.7333) خوانده شد و طبق فرمول ميزان هر آنزيم، محاسبه گرديد.
محاسبه آنزيم ALT: نحوه محاسبه اين آنزيم بدين صورت است که ابتدا نمونه l)µ 100( با معرف اول (lµ 1000) ترکيب شده و پس از مخلوط نمودن، 5 دقيقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه ميگرديد. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوري را بعد از 1 دقيقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقيقاً پس از 1، 2 و 3 دقيقه، اختلاف جذب نوري از دقيقه قبل تعيين گرديد. در نهايت مقدار اختلافات جذب نوري پس از دقايق 1، ?و 3 با هم جمع و بر عدد 3 تقسيم و ميانگين بدست آمده در عدد 19?? ضرب گرديد.
محاسبه آنزيم AST: نحوه محاسبه اين آنزيم در روشي کاملاً مشابه به آنزيم ALT انجام ميگيرد.
محاسبه آنزيم ALP: نحوه محاسبه اين آنزيم بدين صورت است که ابتدا نمونه l)µ 20( با معرف اول (lµ 1000) ترکيب شده و پس از مخلوط نمودن، 1 دقيقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه ميگرديد. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوري را بعد از 1 دقيقه در طول موج 405 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقيقاً پس از 1، 2 و 3 دقيقه، اختلاف جذب نوري از دقيقه قبل تعيين گرديد. در نهايت مقدار اختلافات جذب نوري پس از دقايق 1، ?و 3 با هم جمع و بر عدد 3 تقسيم و ميانگين بدست آمده در عدد 3433 ضرب گرديد.
محاسبه آنزيم LDH: نحوه محاسبه اين آنزيم بدين صورت است که ابتدا نمونه l)µ 10( با معرف اول (lµ 1000) ترکيب شده و پس از مخلوط نمودن، 1 تا 5 دقيقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه ميگرديد. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوري را بعد از 1 دقيقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقيقاً پس از 1، 2 و 3 دقيقه، اختلاف جذب نوري از دقيقه قبل تعيين گرديد. در نهايت مقدار اختلافات جذب نوري پس از دقايق 1، ?و 3 با هم جمع و بر عدد 3 تقسيم و ميانگين بدست آمده در عدد 20000 ضرب گرديد.


پاسخ دهید