3-3-11- برش وکتور pET-21a (هضم شده با Nde?) توسط BamHI43
3-3-12- ليگاسيون وکتور pET-21a و ژن سنتتيک dr241844
3-3-13- ترنسفورماسيون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5?45
3-4- توالييابي ژن سنتتيک در pET-21a45
3-5- القاء ساختارهاي بياني pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور توليد پروتئين DR2418 داراي برچسب هيستيدين (His-tagged r-dR2418):46
3-6- ارزيابي پروتئين DR2418 توليد شده به وسيله الكتروفورز در ژل پلي آكريلاميد (SDS-PAGE)47
3-7- يكسان سازي غلظت كلي پروتئينها در نمونه هاي قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE50
3-8- شناسائي و تائيد پروتئين His-tagged r-DR2418 با روش Western blot50
3-9- نگهداري و ذخيره باكتريهاي مولد پروتئين ِDR2418:52
3-10- بررسي پايداري پلاسميدها (Plasmid stability Test)53
3-11- خالصسازي پروتئين نوترکيب DR2418 به روش کروماتوگرافي53
3-11-1- ليز سلولي باکتري E.coli54
3-11-2- آماده كردن ستون54
3-11-3- تزريق نمونه و شستشو55
3-11-4- جدا سازي يپروتئين نوترکيب55
3-11-4-1- روش دياليز56
3-11-5-1- رسم منحني استاندارد56
3-11-5-2- تهي? محلول برادفورد57
3-11-6- بازيافت و نگهداري ستون57
فصل چهارم : نتايج58
4-1- غربال كردن كلني هاي حاوي pGEM-B1 داراي قطعه DR2418:59

4-2- غربال كردن كلنيهاي E. coli DH5 حاوي pGEM-B1 داراي قطعه59
4-2-1- تاييد پلاسميدهاي استخداج شده با برش آنزيمي NdeI:60
4-2-2- تاييد پلاسميدهاي خطي شده حاوي ژن سنتتيک با هضم آنزيمي BamHI:60
4-3- جداسازي قطعه از روي ژل و فرايند Ligation:61
4-3-1- تاييد صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعيين توالي:63
4-4- ترانفسفورم وکتور pET21a حاوي ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزيابي بيان پروتئين DR2418:64
4-5- شناسائي و تائيد پروتئين DR2418 با روش Western Blot Wet transfer))64
4-6- بيان ژن dr2418 در حجم يک ليتر محيط کشت66
4-7- برسي تخليص پروتئين بر روي ژل SDS_PAGE:67
4-8- نتايج سنجش غلظت پروتئين:67
فصل پنجم : بحث و نتيجه گيري69
ضميمه:76
پيشنهادات:84
منابع85
چكيده انگليسي91
فهرست شکل ها
عنوانصفحه
شکل 1. مسيرهاي سميت زدايي سوپراکسيد اکسيژن5
شکل 2. سينتيک ترميم ژنوم D .radiodurans و T. gammatolerans بعد از اينکه در معرض اشعه گاما قرار مي گيرند.11
شکل 3. مسيرهاي مختلف ترميم DNA دورشته اي12
شکل 4. مدل شماتيک از ارتباط حيات باکتري و پروتئين PprI و مسيرهاي فعال شده.17
شکل 5: ساختار شيميايي سيتونمين23
شکل 6: توليد سيتونمين در حضور تابش فرابنفش.26
شكل 7. الكتروفورز پلاسميدهاي استخراج شده از كلني هاي ترانسفورم شده با pGEM-B1 داراي قطعه.59
شکل 8. هضم آنزيمي پلاسميدهاي pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک توسط آنزيم NdeI60
شکل 9. هضم آنزيمي پلاسميدهاي pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک خطي شده توسط آنزيم BamHI61
شکل 10. جداسازي قطعه ژن سنتتيک از روي ژل بمنظور تخليص آن62
شکل 11. لاين 1: وکتور pET 21a، لاين 2 تا 5: وکتور pET 21a حاوي ژن سنتتيک62
شکل 12. نتايج همرديفي پلاسميد pET21a حاوي ژن مورد نظر (T7 promoter) و ژن سنتز شده (Synthesized).63
شكل 13. بررسي الگوي پروتئيني DR2418 بيان شده در E. coli Origami65
شكل 14. شناسائي و تائيد پروتئين DR2418 با روش وسترن بلات65
شكل 15. تاييد بيان پروتئين DR2418 در حجم يک ليتر محيط کشت با روش SDS-PAGE:66
شکل16. برسي پروتئين DR2418 بعد از تخليص از روي ستون کروماتوگرافي بر روي ژل SDS_PAGE67
فهرست جداول و نمودارها
عنوانصفحه
جدول 1: محصولات متابوليکي ميکروبي توليد شده ناشي از القاء پرتو فرابنفش و پيامدهاي درماني آنها.20
جدول 2: نقش دارويي اکستريموليت هاي جداسازي شده از اکستريموفيل هاي مقاوم به پرتو فرابنفش24
نمودار1: منحني استاندارد (کاليبراسيون) غلظت؛ رسم شده با استفاده از غلظتهاي 50، 100، 250 و 500 ميليگرم در ليتر محلول BSAدر طول موج 595 نانومتر68
چکيده
زمينه و اهداف: داينوکوکوس راديودورانس يکي از ميکروارگانيسم هاي مقاوم به پرتو است و مي تواند در محيط هاي خشن به حيات خود ادامه دهد. مطالعات نشان مي دهد که چندين پروتئين آنتي اکسيدان و ترميم کننده DNA در مقاومت بخشي به پرتو نقش دارد. پروتئين DR2418 يکي از پروتئين هاي تنظيمي مهم در داينوکوکوس راديودورانس در مقاومت بخشي به پرتو است. هدف از اين مطالعه کلونينگ و بيان ژن dr2418 در E. coli و تخليص پروتئين اين ژن مي باشد.
روش کار: ژن dr2418 داينوکوکوس راديودورانس بصورت سنتتيک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بياني pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونينگ توسط هضم آنزيمي و توالي يابي تاييد شد. ژن dr2418 در E. coli بيان شد و پروتئين نوترکيب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلي اکريل آميد و وسترن بلاتينگ تاييد شد.همچنين با استفاده از ستون کروماتوگرافي جذبي اين پروتئين تخليص گرديد.
نتايج: پلاسميد pET21a حاوي ژن dr2418 به همراه برچسب هسيتيديني در قسمت C-ترمينال بطور موفقيت آميز ساخته شد. هم چنين، پروتئين نوترکيب DR2418بصورت داخل سلولي در E. coli ترانسفورم شده توليد ، و تخليص آن با موفقيت انجام شد.
نتيجه گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد که پروتئين rDR2418 مي تواند به عنوان يک کانديد مناسب پروتئين مقاوم به پرتو در نظر گرفته شود. بااين حال، خاصيت مقاومت به پرتو پروتئين DR2418 بايد در سيستم هاي پروکاريوتي و يوکاريوتي آناليز شود.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

فصل اول:
مقدمه و کليات
محيطهاي داراي پرتوزايي جزء محيطهاي خشن (Extreme) ميباشند و در اين محيطها ميکروارگانيسمهاي مقاوم به اشعههاي راديواکتيو در خانوادههاي مختلف باکتريايي يافت ميشوند. به عنوان مثال گونههاي جنس Deinococcus حتي در دوزهاي 25 KGy از خود مقاومت نشان ميدهند که يکي از معروفترين گونههاي متعلق به جنس Deinococcus و مقاوم به اشعه، Deinococcus radiodurans ميباشد، بطوريکه اين باکتري حتي در پرتوهاي با دوز بالا به حيات خود ادامه ميدهد. اين باکتري جزء باکتريهاي غير بيماريزا است و ميتوان آن را از محيطهاي طبيعي جداسازي نمود و در محيطهاي کشت آزمايشگاهي آن را کشت داد. مطالعات مختلفي در مورد مکانيسم مقاومت Deinococcus radiodurans به اشعه راديواکتيو انجام شده است و مطالعات نشان ميدهد که ژنهاي کدکننده پروتئينهاي دخيل در ايجاد مقاومت به اشعه در اين باکتري وجود دارد ولي مکانيسم مولکولي آن هنوز بطور کامل مشخص نشده است. با اين حال مطالعات اخير ژنهاي مختلفي از قبيلDR2418، DR1709، pprI، RecX را گزارش کردهاند که در ايجاد مقاومت به اشعه داراي نقش بسزايي ميباشند و عملکرد آنها در زمينه از بين بردن راديکالهاي سمي اکسيژن و ترميم DNA آسيب ديده ميباشد.
محيطهاي خشن (Extreme) يکي از محيط هاي پرچالش براي ارگانيسم هاي زنده است. با اين حال، تعداد زيادي از ميکروارگانيسمهاي متعلق به سه قلمرو حيات (باکتريها، يوکاريوتها و آرکيها) از محيطهاي خشن مانند هيدروترمال و محيطهاي خشک در معرض اشعه UV، محيط هاي بسيار گرم جداسازي شده اند. در ميان اين ارگانيسمهاي مقاوم به شرايط خشن، باکتريهاي متعلق به خانواده Deinococcaceae توانايي بسيار بالايي براي زيستن در محيط هاي در معرض اشعه هاي يونيزان دارند و Deinococcus radiodurans يکي از بهترين گونه هايي است مورد مطالعه قرار گرفته است.
اين باکتري توسط توانايي استثنايي اش در مقابله با اثرات تخريب کننده ساختار DNA از جمله اشعه يونيزان، نور ماوراي بنفش و شرايط خشکي مورد شناسايي قرار گرفته است.
اشعههاي يونيزان توسط تخريب عناصر راديواکتيو توليد مي شود و منجر به توليد الکترون ها و يون هاي مختلف مي شود. اشعه هاي گاما فوتون هايي هستند که مولکول هاي سلولي را تغيير مي دهند و راديکال هاي هيدروکسيل بسيار فعال توليد مي کنند (ROS) بخصوص OH. توسط يونيزاسيون مولکول هاي آب. اين راديکال هاي آزاد بطور مستقيم و غيرمستقيم باعث تخريب DNA مي شوند و تغييرات بازي و شکست دورشته و تک رشته DNA را بوجود مي آورند. مطالعات نشان مي دهد که 80% از تخريب DNA ناشي از عملکرد ROS است و فقط 20% توسط برهم کنش مستقيم فوتون هاي گاما و DNA است و تعداد شکست هاي DNA دو رشته اي نسبت مستقيم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E , 2001). اولين مسير حفاظت عليه استرس اکسيداتيو وجود آنزيم هاي آنتي اکسيدان همانند سوپراکسيد ديسموتاز و کاتالاز است که بيومولکول ها را از آسيب هاب ناشي از ROS محافظت مي کند (شکل 1). سوپراکسيد ديسموتاز تبديل اکسيژن را به سوپراکسيد اکسيژن کاتالير مي کند تا در نهايت پراکسيد هيدروژن به H2O تبديل شود (شکل 1). مطالعات نشان مي دهد که D. radiodurans در هنگام مواجه با اشعه يونيزان سه نوع سوپراکسيد ديسموتاز و سه کاتالاز کد مي کند. در آرکي ها، سوپراکسيد ديسموتاز توسط ارگانيسمهاي هوازي (نظير Halobacterium) و چند ارگانيسم بي هوازي مانند Methanosarcina barkeri کد مي شود. در ارگانيسم هاي بي هوازي سوپراکسيد ردوکتاز (SOR) کد مي شود (شکل 1). سوپراکسيد ردوکتاز در هنگام اکسيده شدن نياز دارد تا توسط روبردوکسين احيا شود که خودش هم توسط آنزيم NAD(P)H روبردوکسين اکسي ردوکتاز (NROR) اکسيده مي شود. در نهايت پراکسيد به H2O توسط عملکرد روبرترين تبديل مي شود. علاوه بر اين، بعضي از ارگانيسم هاي بي هوازي، از مسيرهاي بدون توليد پراکسيد هيدروژن، براي حذف سوپراکسيد استفاده مي کنند (تصوير C1). مطالعات کريستالوگرافي نشان مي دهد که سوپراکسيد ردوکتاز با فروسيانين کمپلکس تشکيل مي دهد (Adam V , 2004). اين کمپلکس بطور موثر با راديکال هاي سمي اکسيژن واکنش مي دهد و محصول نهايي واکنش پراکسيد هيدروژن نيست اما فورمات و H2O توليد ميشود (شکل 1).
شکل 1. مسيرهاي سميت زدايي سوپراکسيد اکسيژن در (A) هوازي ها و ارگانيسم هاي بي هوازي (B و C). Cyt bd: سيتوکروم bd يوبي کوئينول اکسيداز. Prx: پروکسي ردوکسين، rd: روبردوگسين، SOD: سوپراکسيد
ديسموتاز، SOR: سوپراکسيد ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسين اکسي ردوکتاز.
در اين تحقيق در نظر است پروتئين DR2418 به صورت نوترکيب تهيه تا در تحقيقات آتي از آن استفاده شود.
به طور خلاصه اهدف اين تحقيق به شرح زير است:
_ با توجه به اينکه ژنهاي ايجادکننده مقاومت به اشعه در باکتري Deinococcus radiodurans وجود دارد، مي توان عملکرد اين ژنها را در مقياس آزمايشگاهي بررسي نمود. بنابراين هدف از اين مطالعه، تهية پروتئيني بود که در مقاومت باکتري نسبت به پرتو نقش دارد. در تحقيقات آتي ميتوان از آن براي تهية مواد ضدپرتو استفاده نمود.
_ کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بياني pET21
_ بررسي ميزان بيان پروتئين DR2418 در ميزبان E.coli origami
_ خالصسازي پروتئين نوترکيب DR2418 به روش کروماتوگرافي
فصل دوم:
مروري بر تحقيقات انجام شده
پيشينه تحقيق:
يکي از شگفت انگيز ترين ارگانيسم هاي کشف شده تا به امروز Deinococcus radiodurans مي باشد. اين باکتري در سال 1956 توسط Artthur W. Anderson کشف شد. در حاليکه آرتور براي استريل کردن کنسروهاي گوشت از اشعه گاما استفاده کرده بود بعد از مدتي متوجه فساد گوشت کنسرو شده شد و تنها ميکرو ارگانيسمي که توانست از گوشت جدا کند Deinococcus radiodurans بود.ژنوم اين باکتري در سال 1999 توسط Tiger A توالي يابي شد و تحليل و بررسي دقيق ژنوم باکتري در سال 2001 به پايان رسيد.
Deinococcus radiodurans توانائي هاي مختلفي در جلوگيري از آسيب هاي اشعه راديو اکتيو و همچنين ترميم DNA تک رشته اي خود دارد. D.radiodurans يک باکتري نسبتا بزرگ ، کروي است که معمولا 4 سلول به هم متصل شده و تشکيل تتراد مي دهند.
در مطالعه انجام شده توسط WANG LiangYan و همکارانش در سال 2012 نشان داده شد که بيان همزمان PprI و DR2418 در سلول E. coli حفاظت بخشي عليه اشعه گاما و ترميم DNA را افزايش مي دهد بطوريکه موتانت هاي فاقد اين دو ژن بسيار حساس تر به اشعه گاما هستند. هم چنين موتانت هاي فاقد PprI و DR2418، در دو ژن recA و PprA کاهش بيان دارند و در بازآرايي ژنوم نقص دارند و مقاومت آن ها به اشعه کاهش مي يابد. علاوه بر اين، نتايج اين مطالعه نشان داد که حذف ژني PprI در سويه هاي وحشي اشعه ديده باعث کاهش بيان DR2418 مي شود. بنابراين، توليد پروتئين PprI بيان drRRA را تحت تاثير قرار مي دهد. هم چنين يک پروتئين جديد به نام PprM (Cold shock protein) در پاسخ به اشعه نقش دارد که توسط ژن PprI کنترل مي شود (WANG L, 2012).
Duohong Sheng و همکارانش در سال 2005 نشان دادند که پروتئين RecX در باکتري داينوکوکوس به عنوان يک رپرسور براي بيان recA عمل مي کند و افزايش بيان RecX مقاومت پذيري سلول را براي اشعه گاما کاهش مي دهد. هم چنين نتايج اين مطالعه نشان داد که RecX در باکتري داينوکوکوس فعاليت آنتي اکسيدانتي را مهار مي کند (Jong ll K, 2009). Tian و همکاران در گزارش خود الکتروفورز دو بعدي انجام دادند که توانستند در بين ده سويه وحشي داينوکوکوس يک سويه با باند پروتئيني متفاوت، که پروتئين DR2418 ناميده شد، شناسايي کنند.
در مطالعات قبلي نشان داده شده است که متابوليسم آنتي اکسيدانتي در باکتري هاي مقاوم به اشعه نقش بسيار مهمي دارد. مطالعات نشان مي دهد که پروتئين DR2418 در باکتري D. radiodurans مي تواند بطور قابل توجهي بيان ژن هاي recA و pprA را القا کند و فعاليت آنزيماتيک کاتالاز را در اين باکتري افزايش دهد. موتانت هاي DR2418 به اشعه گاما بسيار حساس هستند و قابليت سلول براي جلوگيري از آسيب هاي ناشي از راديکال هاي آزاد بطور قابل توجهي کاهش مي يابد (P.R.Bianco, 1998). پروتئين recA نقش بسيار حساس در نوترکيبي هومولوگ و تنظيم سيستم ترميمي SOS دارد که نقش شکست پروتئوليتيکي رپرسور LexA در باکتري E. coli دارد که منجر به فعال سازي رگولون SOS مي شود. ژن recA در باسيلوس سوبتيليس توسط رونويسي فاکتور ComK فعال مي شود که براي از بين بردن LexA لازم است. recA در D. radiodurans مقاوم به اشعه شباهت هاي عملکردي با recA در باکتري E. coli و باسيلوس سوبتيليس دارد که از نظر توالي اسيدآمينه اي همانند هم هستند. سويه هاي موتانت recA نسبت به سويه هاي وحشي بسيار حساس به اشعه هستند. پروتئين DR2418 فقط در D. radiodurans وجود دارد و در ساير سويه ها و باکتري هاي مقاوم به پرتو وجود ندارد. راديکال هاي اکسيژن و هيدروژن پرکسيد از شکست مولکول هاي آب توسط اشعه بوجود مي آيد که منجر به آسيب به غشاي سلولي، DNA و پروتئين مي شود (C.Bonacossa, 2002). در مطالعات نشان داده شده است که سويه هاي E. coli حاوي ژن dr2418 داراي فعاليت نسبي بيشتر در از بين بردن راديکال هاي سمي اکسيژن هستند. مکانيسم دفاعي معمول در سلول عليه O2•- و H2O2 توسط آنزيم هاي داراي فعاليت آنتي اکسيداني سوپراکسيد ديسموتاز و کاتالاز انجام مي گيرد. بيان ژن PprI در E. coli منجربه افزايش بيان KatG مي شود که با افزايش دوز اشعه گاما ميزان بيان KatG افزايش مي يابد (Ohba H,2009).
در مطالعه اي که توسط Huiming Lu و همکاران در سال 2009 صورت گرفت نقش پروتئين Ppr1 و نقش تنظيمي آن بعد از قرار گرفتن باکتري Deinococcus radiodurans در معرض تابش شديد اشعه مشخص شد. آن مطالعه بر اساس مقايسه بين سويه وحشي R1 و سويه اي که ژن Ppr1 آن حذف شده بود صورت گرفت و مشخص شد در سويه وحشي يک سري از ژن ها به دنبال Ppr1 بيان شده و فعاليت هاي مختلفي از جمله رونويسي ، متابوليسم ، و ترميم به صورت کامل تر و متفاوت با سويه فاقد ژن Ppr1 پيش مي رود و سويه وحشي توانايي بالاتري در مقايسه با سويه فاقد ژن Ppr1 در مواجهه با اشعه راديو اکتيو دارد.(Huiming Lu, 2009).
2-1- ترميم شکستگيهاي DNA دورشتهاي:
شکست هاي DNA دورشته اي بسيار خطرناک بوده و بايد ترميم گردد. با اين حال، باکتري D .radiodurans و آرکي T. gammatolerans ميتوانند دوزهايي از اشعه گاما را تحميل شوند که هزاران شکست در طول DNA دورشتهاي و در طول ژنوم ايجاد مي کند. پروتئين هاي مختلفي در ترميم DNA دخيل هستند. سنتيک ترميم شکستگي DNA دورشته اي در D .radiodurans بعد از مواجه شدن با 6800 Gy اشعه گاما خيلي سريع است و هنگامي که سلول ها بعد از مواجه شدن با اشعه در محيط کشت غني قرار مي گيرند بعد از دو تا سه ساعت خود را ترميم مي کند (Krisko A , 2013) (شکل 2).
شکل 2. سينتيک ترميم ژنوم D .radiodurans و T. gammatolerans بعد از اينکه در معرض اشعه گاما قرار مي گيرند. D .radiodurans و T. gammatolerans در طي فاز رشد لگاريتمي به ترتيب در دوزهاي 6800 Gy يا 5000 Gy اشعه گاما قرار گرفتند و سپس در محيط کشت غني شده در دماي 30 درجه سانتي گراد براي D. radiodurans و 85 درجه سانتي گراد براي T. gammatolerans جهت ترميم خود قرار گرفتند. جهت جلوگيري از شکست مکانيکي DNA در آزمايشگاه سلول ها محبوس شدند و با آنزيم محدودالاثر بريده شدند.
2-2- مکانيسم ترميم شکستگي DNA دورشته اي:
چندين مکانيسم براي ترميم موثر DNA دورشته اي نشان داده شده است. جهت ترميم DNA توسط روش نوترکيبي هومولوگ، متصل شدن تک رشته اي (SSA) يا سنتز رشته ها وابسته به چسبيدن رشته (ESDSA)، سلول ها نياز به يک کپي کامل ديگر از DNAآسيب ديده باشند. بر خلاف آن، اتصال انتهايي غيرهومولوگ (NHEJ) به کپي دوم از DNA جهت اتصال رشته هاي کانتيگ نياز ندارند (Hefferin ML, 2005).
2-2-1- نوترکيبي هومولوگ (HR):
مسير اصلي در ترميم شکست DNA در باکتري ها و مخمر ساکاروميسس سرويزيه است. HR از DNA هومولوگ کامل براي ترميم توالي هاي آسيب ديده DNA استفاده مي کند. اولين مرحله ترميم DNA دورشته اي توسط روش نوترکيبي هومولوگ، پردازش انتهاي DNA براي بوجود آوردن DNA تک رشته اي آويز وجود دارد که RecA در باکتري ها و RadA در آرکي ها و Rad51 در سلول هاي يوکاريوتي براي تشکيل رشته هاي نوکلئوپروتئين فراخواني مي شوند. مرحله بعدي HR تعويض رشته هاي DNA است (Setiz EM, 1998).
شکل 3. مسيرهاي مختلف ترميم DNA دورشته اي
2-2-2- اتصال تک رشته (SSA):
علاوه بر نوترکيبي هومولوگ، SSA نشان داده شده است در سلول هاي اشعه ديده داينوکوک اتفاق مي افتد، بطوريکه شکست DNA دورشته اي ترميم مي شود. فرايند SSA مي تواند اتفاق بيافتد اگر دورشته DNA آسيب ديده در يک منطقه از کروموزوم وجود داشته باشند. بعد از واکنش انجام شده توسط اگزونوکلئاز، DNA آويز شده تک رشته اي ايجاد مي شود. اگر DNA آويز شده داراي توالي هاي مکمل باشد، آنها مي توانند به هم متصل شوند. سپس، منطقه تک رشته اي موجود در کروموزوم دوباره ساخته شده توسط سنتز DNA پر مي شود.
2-2-3- سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA):
Zharadka و همکارانش در سال 2006 يک مدل از SSA به نام ESDSA پيشنهاد کردند، بر طبق اين مدل، انتهاي تک رشته يک قطعه به قطعه هم پوشان حمله مي کند و سنتز DNA آغاز مي شود. با اين حال، بر خلاف آنچه که در همانندسازي کلاسيک DNA مي شود، قطعات تک رشته اي تازه سنتز شده DNA توسط جابجاشدگي D-loop ايجاد مي شود. اگر انتهاي قطعات DNA تک رشته اي تازه شنتز شده مکمل هم باشند مي توانند به هم متصل شوند و تشکيل DNA دورشته اي بلند تسهيل مي شود که در نهايت اين رشته ها به هم متصل شده و DNA حلقوي را ايجاد مي کند (Zahra dka K, 2006).
اغلب تغييرات بحراني و خشن در محيط سلول ها، يك سري از ژن ها را كه محصول پروتئيني آنها از سلول حفاظت مي كند، فعال و بيان ميکند. اين محصولات باعث كاهش اثرات بحراني و خشن در سلول مي شوند. يکي از مکانيسم ها که در بين همه سلول ها ديده شده است، مکانيسم Heat shock response است. معمولا در مواردي كه سلول در تغييرات دماي بالا قرار گرفته است. پروتئين هاي heat shook پايداري و ترميم پروتئين هايي از سلول كه تا قسمتي دناتوره شده اند را باعث مي شوند. سلول ها همچنين داراي مكانيزم هايي هستند كه سطح آنزيم هاي ترميم DNA را مثل يك حالت اورژانسي در پاسخ به آسيب ديدگي DNA بالا مي برد. بهترين مورد مطالعه شده در E. coli گزارش شده است . اين سيستم به نام پاسخ SOS خوانده مي شود . هر عاملي كه جلوي سنتز مولكول DNA را بگيرد و باعث آسيب به دو رشته اي DNA گردد يك سيگنال القايي براي افزايش نسخه برداري بيشتر از ?? ژن را پديد مي آورد كه بيشتر اين ?? ژن براي بيان پروتئين هايي هستند كه در ترميم DNA نقش دارند . اين سيگنال القايي به نظر مي رسد حضور DNA تك رشته اي است كه در ابتدا پروتئين RecA را فعال مي كند. پروتئين RecA قادر است مهار كننده نسخه برداري يك سري بزرگ از ژن ها را تخريب كند و در نتيجه پاسخ SOS از اين جا آغاز مي گردد ولي در كنار آن جهش هم وجود دارد كه به آن Error prone مي گويند. سلول ها هم چنين يك مكانيسم ديگر براي كمك به پاسخ ترميمي مولكول DNA دارند. آنها از پيشرفت سيكل مولكولي جلوگيري مي كنند تا زماني كه ترميم DNA كامل شود . پروتئين SalA يكي از پروتئين هاي حاصل پاسخ SOS است كه از پيشرفت تقسيم سلولي جلوگيري مي كند (Sriniva san S, 2012).
2-3- ساختار نوکلئوتيد
کروموزوم باکتريايي با يکسري از پروتئين ها در ارتباط است که يک ساختار فشرده به نام نوکلئوئيد را ايجاد مي کند. ساختار نوکلئوئيدي اجزاي خانواده جنس Deinococcus و Rubrobacter داراي فشردگي بالايي هستند و بعد از اشعه دهي گاما بدون تغيير باقي مي ماند. انتشار محدود انتهاي DNA ممکن است يک توضيح مناسبي براي ترميم پربازده شکست هاي DNA دورشته اي باشد که در معرض دوزهاي بالاي اشعه قرار گرفته است. هم چنين مطالعات نشان مي دهد که 4 تا 10 کپي از ژنوم داينوکوکوس راديودورانس همرديف مي شوند و جستجوي هومولوژي براي ترميم شکستگي هاي DNA دو رشته اي راحت مي شود. در E. coli تعداد فراواني از پروتئين هاي HU مشابه هيستون با نوکلئوئيد باکتري ارتباط دارد و در سلول هاي اشعه ديده با اشعه گاما بسيار حايز اهميت است. در D. radiodurans پروتئين HU در بقاي سلول حايز اهميت است و از يک پلاسميد حساس به حرارت بيان مي شود و نقش مهمي را در سازمان ساختار نوکلئوئيد ايفا مي کند (Zimmerman, 2005).
2-4- پاسخ سلول هاي داينوکوکوس متعاقب اشعه گاما:
آناليز ترانسکريپتوم D. radiodurans يک گروه جديد از ژنهايي را نشان ميدهد که در پاسخ به اشعه هاي يونيزان و خشکي بيشتر بيان مي شوند. در ميان 72 ژن که در طي يک ساعت بعد از اشعه گرفتن بشيتر بيان مي شوند و همينطور 33 ژن بعد از ايجاد شرايط خشکي در اين باکتري بيان مي شوند. فقط تعداد محدودي از ژن هاي دخيل در فرايند ترميم DNA مانند RecA در ميان اين ژن ها وجود دارد. 5 ژن که در پاسخ به استرس به ميزان زياد بيان مي شوند عبارتند از ddrA، ddrC، ddrD و pprA. اين ژن ها در D. geothermalis و D. deserti بصورت حفاظت شده وجود دارد. ، پروتئين DdrA با ميل ترکيبي بالا به تک رشته DNA و به انتهاي ‘3 متصل مي شود و آن را از تخريب توسط اگزونوکلئازI محافظت مي کند. همچنين DdrA در پايداري سوبستراهاي نوترکيب ، به ويژه در حضور تعداد زيادي از شکست هاي DNA دخيل است. پروتئين DdrB با ميل ترکيبي بالا به DNA تک رشته متصل مي شود و اتصال مکمل DNA تک رشته را تحريک مي کند. مشخص شده است کهDdrB براي ترانسفرماسيونDNA پلاسميدي ضروري است و پيش و پس از تابش به نوکلئوئيد به صورت گذرا به کار گرفته مي شود. DdrB بازسازي قطعات کوچک بي شماري را توسط فرآيند اتصال تک رشته (SSA) براي توليد سوبسترهاي مناسب براي ESDSA تسهيل مي کند ((Alice Devigne1, 2013. PprA از تجزيه انتهاي DNA دورشته اي حفاظت مي کند و فعاليت DNA ليگاز را تحريک مي کند و نقش PprA را در مسير NHEJ نشان مي دهد. هم چنين سه سوپراکسيد ديسموتاز و سه کاتالاز بيومولکولهاي سلولي را از راديکال هاي سمي اکسيژن محافظت مي کند (Imly JA, 2003).
2-5- ژن هاي دخيل در مقاومت بخشي به اشعه:
مطالعات توالي يابي ژنوم در مورد باکتريهاي D. radiodurans R1 و D. geothermalis به اتمام رسيده است. مطالعات ژنتيکي سويه هاي حساس به اشعه داينوکوکوس باعث شده است که ژن هاي جديد تنظيمي جديد از قبيل dr0167 که جديدا PprI نام دارد کشف شود. پروتئين PprI مي تواند رونويسي recA و pprA را تحريک کند که پروتئين هاي دخيل در ريکاميناسيون مي باشند. بطور قابل توجهي، افزايش بيان ژن PprI در E. coli تحت کنترل GroESL ترميم DNA و حفاظت بخشي عليه آسيب هاي اکسيداتيو را افزايش مي دهد. هم چنين، مطالعات نشان مي دهد که پروتئين PprI داراي توالي هاي مشابه با دو موتيف عملکردي است: موتيف روي متالوپپتيداز (Zinc-binding signature) و پروتئين تنظيمي باکتريايي (lacI family signature) که نشان مي دهد که اين پروتئين داراي فعاليت عملکردي است. هم چنين اين ژن توسط Battista و هم کارانش شناسايي شد و irrE نام گرفت. مطالعات نشان مي دهد که حذف کامل ژن PprI بيان ژن recA را تحت تاثير قرار مي دهد. محصول ژن recA براي ترميم DNA باکتري داينوکوکوس در شرايط آسيب DNA بسيار ضروري است. ژن PprA نيز يکي ديگر از ژنهايي است که در ترميم DNA نقش دارد و توسط ژن PprI کنترل مي شود. در شرايطي که سلول ميکروبي تحت تاثير اشعه قرار ميگيرد مرگ سلولي توسط هيدروژن پراکسيد و راديکال هاي سمي اکسيژن اتفاق ميافتد (آسيب غشاي سلولي، پروتئينها و اسيدهاي نوکلئيک) ولي پروتئين PprI خاصيت آنتي اکسيدانتي دارد و باعث حفاظت بخشي سلول ميشود. پاسخ به آسيب DNA توسط مسيرهاي سيگانال ترانسداکشن، ترانسديوسرها و افکتورها انجام مي شود. فعال شدن PprI به عنوان يک سوئيچ، بيان بسياري از ژن هاي دخيل در ترميم DNA مانند recA، pprA و کاتالاز را فعال ميکند. با اين که اين ژن مختص باکتري داينوکوکوس ميباشد ولي مطالعات در سيستم هاي يوکاريوتي نيز در حال انجام ميباشد (Ghosal D, 2005). بيان ژن PprI در E. coli ترميم DNA و حفاظت بخشي اکسيداتيو را افزايش مي دهد و باعث حفاظت بخشي عليه اشعه مي شود (شکل 4).

شکل 4. مدل شماتيک از ارتباط حيات باکتري و پروتئين PprI و مسيرهاي فعال شده.
شبکه تنظيمي: در E. coli، ترميم آسيب DNA در القاي عملکرد SOS است که اين فرايند درگير فرايندهايي است که توسط RecA و LexA ميانجيگري ميشود. D. radiodurans داراي دو مولکول لومولوگ LexA است که بعد از تخريب DNA، RecA فرايند ترميم را ميانجي گري مي کند. با اين حال، در D. radiodurans هيچ رگولون تحت کنترل پروتئين هاي LexA1 و LexA2 شناسايي نشده است (Ghosal D, 2005).
2-6- منابع ميکروبي مقاوم به پرتو فرابنفش و پيامدهاي درماني:
منابع متابوليکي ميکروبي (يعني اکستريموليت) ترکيباتي آلي هستند که منحصر به فرد بوده و به طور مستقيم در رشد طبيعي، توسعه و يا توليد مثل موجودات درگير نيست؛ با اين حال، به علت عدم وجود اثر آنها در طولاني مدت موجب اختلال در بقاي ارگانيسم، باروري و يا ريخت شناسي آن مي گردد. اين ذخاير ميکروبي به طور گسترده اي از لحاظ اهميت صنعتي بررسي شده اند، با اين حال، پيامدهاي درماني همچنان باقي مانده تا مورد بررسي قرار گيرد. سازگاري ميکروبي در زنده ماندن در شرايط اکستريم وابسته به متابوليسم منحصر به فردي است که يک عامل کليدي در تنوع گسترده ميکروبي است. ظهور ابزارهاي تحليلي عمده در ژنوميکس، پروتئوميکس و متابولوميکس، در تعيين ژن ها و پروتئين هايي که ممکن است در تنظيم ذخاير متابوليک ميکروبي در شرايط سخت محيطي کمک نمايد امروزه از توجه بالايي برخوردار است. در طول دهه گذشته، پيشرفت هاي شگفت انگيزي در تحقيقات در ارتباط با عوامل مختلف ضد سرطان با مطالعه موجودات زنده دريايي، که تحت شرايط بسيار سخت زنده مانده اند، به ثمر رسيده است (Makarova KS, 2007).
جدول 1 به طور خلاصه تعدادي از محصولات ميکروبي که توليد آنها تحت تابش فرابنفش القاء گرديده و داراي پيامدهاي درماني و يا کاربردي ميباشند، ذکر گرديده است. بعضي از آنها از اکستريموفيلهاي دريايي مشتق شده اند. براي بهره برداري از اکستريموليتهاي حاصل از اکستريموفيلهاي مقاوم در برابر اشعه در کاربرد هاي درماني، جداسازي ميکرو ارگانيسمها ميبايست تحت شرايط سخت زندگي خود صورت پذيرد. شرايط سخت محيطي مانند سطوح بالايي از اشعه UVB، مواد مغذي کم و محتويات فلزات سنگين که در ارتفاعات بالاتر يافت ميشوند. از آنجا که در ارتفاع بالا، تابش فرا بنفش يکي از محدود کننده ترين عوامل غيرزنده براي جوامع ميکروبي بوده و در نتيجه، ميتوان پيش بيني نمود که ميکروارگانيسمهاي جدا شده از ارتفاعات بالاتر داراي خواص مقاومت به تابش پرتو فرا بنفش ميباشند. همراه با ارتفاعات بالاتر، سايتهاي آلوده با زبالههاي راديو اکتيو نيز به عنوان يک منبع حاوي ميکروبهاي مقاوم در برابر اشعه پيشنهاد شده است. Asker و همکارانش سويههاي Deinococcus depolymerans که مقاوم به پرتو هاي فرابنفش و گاما بوده را از سايتهاي راديو اکتيو ژاپن جداسازي نمودهاند. اين سويههاي حاوي رنگدانههاي قرمز بوده، که فرض بر اين است که عمل مقاومت ميکروبي در برابر تابش با انرژي بالا، بر عهده اين رنگدانهها ميباشد (Singh S,P,2010).
جدول 1: محصولات متابوليکي ميکروبي توليد شده ناشي از القاء پرتو فرابنفش و پيامدهاي درماني آنها.

2-7- فوايد اکستريموفيلهاي مقاوم در برابر تابش
ذخاير متابوليک ثانويه اکستريموفيل ها (به عنوان مثال، اکستريموليت و اکستريموزيم ها) به طور مستقيم در بقاء، رشد، توسعه، و توليد مثل ارگانيسم دخيل نيست. با اين حال، حضور اين متابوليت هاي ثانويه به هنگام قرار گرفتن در معرض تابش بر بقاي ميکروبي مؤثر است. ويژگي هاي منحصر به فرد اکستريموليت ها شرايطي فراهم آورد تا برنامههاي کاربردي گسترده اي در بيوتکنولوژي، در محدوده پاکسازي زيستي زباله هاي هستهاي و توليد داروهاي مهم پزشکي توسط Singh و Gabani مورد بررسي قرار گيرد (Asker D,2010 و Singh OV, 2011) .
2-7-1- پيامدهاي دارويي اکستريموليت هاي مقاوم در برابر تابش
پيشرفت هاي صورت گرفته در تحقيقات اکستريموفيل هاي توليد کننده اکستريموليت، نشانه هايي جهت ساخت داروهاي ضد سرطان فراهم آورد. تا به امروز، چندين ترکيب حفاظتي در برابر تابش فرابنفش از اکستريموفيل هاي مقاوم به پرتو، از جمله اسيدهاي آمينه مشابه مايکوسپورين 1(MAA)، سيتونمين2، اکتوئين3، باکتريوروبرين4، اسفاروفورين5، پانارين6 و ملانين7 جداسازي شده است. در جدول 1 خلاصه اي از محصولات مختلف متابوليک ميکروبي که از اکستريموفيل هاي مقاوم در برابر تابش فرابنفش جداسازي شده و پيامدهاي دارويي آنها بيان گرديده است (Shick JM,2002).
MAA توسط يک cyclohexenone يا هسته cyclohexenimine کنژوگه شده با نصف نيتروژن يک اسيد آمينه شناخته شده است و توسط مسير اسيد shikimic از طريق اسيد 3-dehydroquinic و
4-deoxygadusol توليد مي گردد، که به عنوان يک آنتي اکسيدان قوي شناخته شده است. MAA از جلبک هاي قرمز، ستاره دريايي، مرجان ها، ، دينوفلاژل ها و سيانو باکتري ها تحت تابش UVB جداسازي شده است. مايکوسپورين جديد جدا شده از آسکوميست Collema cristatum؛ اثر حفاظت بخش خود را در برابر تخريب غشاء ناشي از تابش فرا بنفش ، تشکيل دايمر پيريميدين و اريتم در کراتينوسيت هاي کشت شده انساني، نشان داد . با توجه به توانايي MAA در جذب تابش فرا بنفش، اين ترکيبات مي تواند به ضد آفتاب هاي UV اضافه گردد. مشخص شده توانايي ضد آفتاب MAA زماني که اين ترکيبات در خارج سلول اعمال شوند تا حد زيادي افزايش يافته است ، که نشان دهنده نقش آنها در جذب نور مي باشد؛ که به منظور افزايش اثرات محافظتي مي توان در صنعت لوازم آرايشي و بهداشتي مورد استفاده قرار گيرد (Dela coba F, 2009). نقش فيزيولوژيکي جايگزين براي MAA به عنوان آنتي اکسيدان مطرح است. برخي از انواع MAA (جدول 2) به عنوان از بين برندهي ROS ناشي از قرار گرفتن در معرض تابش فرابنفش، شناخته شده اند. در ديگر گونه هايي از اکستريموفيل هايي کهMAA توليد مي کنند، بيوسنتز همچنين مي تواندتوسط شوک اسمزي القاء گردد.
فرمولاسيون MAA، به منظور حفاظت سيستم دفاع آنتي اکسيداني از پوست در حضور آسيب پوستي ناشي از تابش فرا بنفش در موش نشان داده شده است. اين نويسندگان همچنين نشان دادند که فرمولاسيون از ضخيم شدن لايه شاخي، لايه مولد اپيدرم، درم و هيپودرم جلوگيري مي کند. MAA هاي مختلف ديگر که نشان داده شده است که داراي آنتي اکسيدان و همچنين نقش حفاظتي در برابر نور را داشته شامل پاليتين، آسترينا، پاليتينول و پاليتن مي باشند (Llewellyn CA, 2010). GAO و Garcia Pichel به طور گسترده به بررسي بيوسنتز و بيوشيمي MAA.پرداختند. در حالي که پيامدهاي مستقيم دارويي MAAاميدوار کننده به نظر مي رسد، به عنوان يک داروي پيشنهادي هنوز در دست بررسي مي باشد. علاوه بر MAA، استفاده از سيتونمين، ترکيب زرد رنگ مايل به قهوه اي و محلول در چربي از سيانوباکتري ها، به عنوان کرم هاي ضد آفتاب پيشنهاد شده است. سيتونمين يک آلکالوئيد ايندولي متقارن متشکل از واحدهاي هتروسيکليک ترکيبي بوده، که از طريق يک پيوند کربن-کربن (شکل 5) اتصال يافته اند. اين ساختار حلقهاي پيچيده و باند هاي دوگانه کونژوگه آن را به يک ترکيب پايدار تبديل نموده و شرايط را براي جذب پرتو فرابنفش فراهم مي آورد. تجزيه و تحليل اسپکتروفتومتري نشان داده است که غلاف سيتونمين در حفاظت سلول ها در برابر تابش فرابنفش ورودي موثر بوده اما نور قابل رويت نيست. مکانيزم القاء توليد سيتونمين به منظور بررسي پيامدهاي بيوتکنولوژي آن نيازمند شناسايي مي باشد. مطالعات متعدد نشان داده اند که دما و تنش هاي اکسيداتيو نوري به تنهايي سطوح سيتونمين را در سيانوباکتري ها افزايش نمي دهد (Dillon JG, 2010).


پاسخ دهید