به علت سفت بودن بافت و عدم توانايي در جذب مواد مورد استفاده در مرغ برگرها از مرغ مادر استفاده نمي شود ولي در محصولاتي که مواد تردکننده استفاده ميشود ميتواند به کار رود، البته از نظر استاندارد استفاده از مرغ مادر به علت آلودگي ممنوع است (Farkas and Singh 1991; Hongsheng, Qingshu et al. 1997).
در توليد خمير مرغ تقلباتي صورت ميگيرد از قبيل:
1) در بعضي از کارخانجات مرغ منجمد را بهطور کامل در دستگاه بادر مياندازند چون همه به صورت خمير درميآيند مشخص نميشود، اين خمير آلودگي بسيار بالايي دارد چون پوست، بال و رگههاي گردن را نمي گيرند.
2) اندازه فيلترها را بزرگتر ميکنند يا دو بار از بادر رد ميکنند که باعث ميشود در محصول ريز استخوانهايي باقي بماند که وقتي خورده ميشود در دهان احساس ميشود. اگر توليد خمير مرغ از اسکلت به صورت اصولي تهيه شود از نظر تغذيهاي مفيد هم ميباشد.
1-3-انواع تقلب در فرآورده هاي غذايي
با افزايش روز افزون جمعيت، تهيه غذاي کافي يکي از مسايل پيچيده ومهم جهان امروز به شمارمي رود. هر ساله ميليون ها مورد بيماري در جهان بر اثر استفاده مواد غذايي ناسالم ديده مي شود. مواد غذايي همواره داراي مشتري و کاربرد عمومي هستند. گاهي ممکن است افراد سودجو و متقلب به فکر استفاده از بازار پر فروش و پر رونق آن بيفتند و براي کم کردن هزينه هاي توليد و به دست آوردن سود بيشتر دست به تقلب در موادغذايي بزنند که از اين راه سلامت مردم را به خطر مي اندازند. بيشتر اين تقلب ها در بازار خرده فروشي هاست؛ اما گاه ممکن است به بازار فروش مواد اوليه هم سرايت کند. بنابراين آشنايي با اين تقلب ها و راه هاي تشخيص آن براي کنترل مواد غذايي بسيار مفيد است (Regattieri, Gamberi et al. 2007; Spink and Moyer 2011).
1-3-1-تقلب در فرآورده هاي گوشتي
تقلب در گوشت قرمز: گوشت و بيشتر فرآورده هاي آن گران قيمت هستند و امکان تقلب در آن ها زياد است.
از جمله تقلب هايي که در فرآورده هاي گوشتي اتفاق مي افتد عبارتند از:
• افزودن مواد ازته غيرپروتئيني به نحوي که در آزمون هاي کنترل مقدار ازت بالا تر به نظر برسد
• افزودن پودر استخوان به فرآورده هاي گوشتي مانند سوسيس و کالباس
• افزودن پودر خون به همبرگر و سوسيس و کالباس
• رعايت نکردن فرمول و استاندارد فرآورده هاي گوشتي و افزودن مقادير زياد مواد پر کننده
• افزودن نيتريت و نيترات به مقدار بيش از حد براي بهبودي رنگ و جلوگيري از رشد ميکروارگانيسم ها در موارد آلودگي شديد
فر آورده هاي گوشتي يکي از پر مصرف ترين فرآورده هاي غذايي به شمار آمده و تنها درکشور آلمان که يکي از بزرگترين توليد کننده هاي فرآورده هاي گوشتي مي باشد بيش از پانصد نوع محصول گوشتي با اسامي مختلف وجود دارد. در ساير نقاط جهان نيز تعداد اين محصولات بسيار فراوان مي باشد و به 1200 نوع مي رسد. با توجه به اين که مصرف فرآورده هاي گوشتي به دلايل مقرون به صرفه بودن اين فرآورده ها نسبت به قيمت خريد گوشت سفيد يا قرمز، تسهيل در پخت و پز و مطلوب بودن طعم آن نسبت به غذاي سنتي، روند رو به رشدي در جامعه پيداکرده است، برخي از توليدکنندگان اين فرآورده ها مبادرت به توليد محصولاتي نموده اند که در توليد آن بافت هاي نامطلوب و غير مجاز نيز به کار برده اند. حضور اين بافت هاي غير مجاز در فرآورده هاي گوشتي يک مشکل حقيقي در شناسايي آن از بافت هاي مجاز آن فرآورده ايجاد مي کند. با اين وضعيت به کار گيري روشي دقيق براي شناسايي بافت هاي غير مجاز در فرآورده هاي گوشتي حرارت ديده غير قابل اجتناب مي باشد تا سطح کيفيت اين نوع فرآورده ها را بيشتر مورد توجه قرار دهد (Anklam and Battaglia 2001). هنگامي که روشي براي شناسايي بافت هاي غير مجاز وجود داشته باشد مي توان مجازاتي را نيز براي افراد خاطي که از بافت هاي غير مجاز در توليد فرآورده هاي گوشتي حرارت ديده استفاده مي کنند تعيين نمود.
1-4-کنترل کيفيت فرآورده هاي گوشتي
کنترل کيفيت مواد غذايي فرآيندي است که ميزان تبعيت يک ماده غذايي بسته بندي شده از برچسب نگاشته شده بر روي خود را بررسي مي نمايد. آرتور هيل براي اولين روشي را جهت بررسي و کنترل کيفيت مواد غذايي در سال 1861 ارائه کرد که به صورت بررسي ميکروسکوپي دارويي انجام شد (Hassall 1876).
تعريف جهاني که از واژه کنترل کيفي و يا اعتبار سنجي وجود دارد طبق قانون 2002/178 کميسيون اروپا است، درواقع يک واژه تعريف شده است که توانايي شناسايي گونه هاي مختلف و فرآورده هاي حيواني را طي مراحل مختلف در زنجيره غذايي (مراحل توليد تا توزيع) نمايان مي کند. از طرفي ديگر مطابق قوانين کميسيون اروپا به منظور ايمني مواد غذايي، در تمام دنيا توليدکنندگان ملزم به آشکارسازي و بيان نام تمام مواد اوليه خام مورد استفاده بر روي برچسب فرآورده هاي غذايي هستند.
امروزه اعتماد به برچسب هاي قرار گرفته شده بر روي فرآورده هاي غذايي و صحت و سقم آن به يکي از چالش هاي توليد کنندگان مواد غذايي در بازار کشاورزي و غذايي تبديل گرديده است (Lenahan, Thomas et al. 1973; Nilsson, Tunçer et al. 2004). اين نياز سبب طراحي مطالعات متعددي در اين زمينه شده است تا بتوانند اعتماد مصرف کنندگان به فرآورده هاي غذايي را به خود جلب کنند. تمامي اين موارد با توجه به افزايش روزافزون نياز مردم جان به فرآورده هاي غذايي آماده و نيمه آماده، افزايش علم عمومي که سبب شناخت آن ها نسبت به خطرات ناشي از مواد غذايي شده است و در نهايت افزايش توجهات به تأثيري که موجودات اصلاح ژنتيک شده مي توانند بر زنجيره غذايي انسان و محيط اطراف گذارند، نشان دهنده اهميت برنامه کنترل کيفيت و اعتبار سنجي ارائه شده مي باشد.
ميزان اعتبار برچسب هاي ارائه شده بر روي مواد غذايي يک مسأله مهم براي مصرف کنندگان و کارشناسان فرآورده هاي غذايي است زيرا عدم تطابق موارد ارائه شده بر روي برچسب قرار گرفته روي فرآورده هاي غذايي با منشأ حيواني مي تواند اثرات منفي قابل توجهي را از جنبه هاي مختلف به دنبال داشته باشد (Angulo, Gil et al. 2005). جنبه هاي مختلفي ذکر شده را مي توان از سه جهت مورد نقد و بررسي قرار داد:
1) تقلب تجاري: با هدف سوء استفاده، توليد کنندگان فرآورده هاي غذايي مي توانند با توجه به قيمت بالاي برخي مواد غذايي، آن ها را با موادي که داراي هزينه پايين تري هستند جايگزين نمايند. همچنين مي تواند علاوه بر قيمت سبب جايگزيني گونه اي با ارزش غذايي کمتر به جاي گونه اي با ارزش غذايي بيشتر شود.
2) ممکن است افرادي به برخي از رژيم هاي غذايي آلرژي داشته باشند و استفاده از آن ها پيامدهاي جبران ناپذيري را به همراه داشته باشد. ذکر موارد اشتباه بر روي فرآورده هاي غذايي مي تواند به سلامت مصرف کننده آسيب برساند.
3) ديگر نکته مهم در بحث فرآورده هاي غذايي ممنوعيت استفاده از برخي گوشت ها در برخي از مذاهب مي باشد. استفاده از اين گوشت ها و عدم بيان آن ها در برچسب ارائه شده بر روي آن مي تواند اثرات روحي رواني نامناسبي بر روي شخص مصرف کننده گذارد.
مطابق با استانداردهاي Appendix، ترکيبات موجود در فرآورده غذايي بايد بصورت زير بر روي برچسب هاي قرار گرفته بر روي بسته بندي فرآورده درج گردند:
• تمام مواد اوليه مطابق استانداردهاي FDA باشند و نام تمام مواد اوليه مورد استفاده در فرآورده به طور مشخص بر روي برچسب بسته بندي درج شود.
• ماده حاصل از هيدروليز پروتئين بايد با نام هاي مورد استفاده و رايج معرفي گردد و نام پروتئين هيدروليز شده بر روي برچسب ذکر شود.
• افزودني هاي رنگي مجاز FDA نيازمند ليستي از نام هاي رايج مي باشند و افزودني هاي رنگي فاقد نام مجاز بايد با نام “رنگ مصنوعي ” و يا “رنگ افزوده ” مشخص گردد.
• محصولات گوشتي فرآوري شده مورد استفاده به عنوان ماده اوليه، بدون نياز به ذکر ميزان استفاده آن ها، نيازمند آشکارسازي کامل تمام مواد اوليه در فرمولاسيون فرآورده هاي گوشت و ماکيان است.
• در فرآورده هاي حاوي مخلوط گوشت و مرغ، اگر يکي (از نظر کمّي) بسيار بيشتر از ديگري بود بايد بر روي برچسب، نام آن ذکر شود و در صورت تساوي مقادير، نام هر دو ذکر گردد.
• در فرآورده هاي حاوي پروتئين گياهي، گوشت تازه و مرغ، اگر ميزان گوشت تازه يا مرغ از پروتئين گياهي بسياربيشتر بود (مثلاً نسبت 13:1) ميزان پروتئين گياهي فريبنده نيست و فقط نياز است که بر روي برچسب مواد اوليه ذکر شود اما در صورتي که اين نسبت کمتر از 13:1 اما بيشتر و يا مساوي 10:1 باشد، بايد نام پروتئين گياهي در کنار نام محصول ذکر شود مثلاً : هات داگ با گوشت گاو و پروتئين گياهي بافت دارافزوده شده (Boylston, Chen et al. 2012).
1-5-تکنيک هاي مرتبط با کنترل کيفي عام
1-5-1-آزمايشات شيميايي
در اين آزمايشات آن ويژگي از ماده اوليه که در تهيه محصول اثر ميگذارد فقط مورد آزمايش قرار مي گيرد، براي مثال در آرد سوخاري ميزان کربوهيدرات را اندازهگيري ميکنند. روزانه به صورت تصادفي يک تا دو نمونه از قسمتهاي مختلف سالن توليد برداشته و آزمايشات شيميايي مورد نظر (مثل درصد چربي، روغن، خاکستر و …) را انجام ميدهند (Love and Pearson 1971).
1-5-1-1-جستجوي پليفسفاتها در گوشت و فرآوردههاي آن
جهت بررسي و اندازه گيري پلي فسفات ها در گوشت و فرآورده هاي غذايي از مراحل زير استفاده مي شود (Klose, Campbell et al. 1963):
• تهيه لايه سلولزي
• تهيه نمونه مورد آزمايش
• تهيه سرم
• جداسازي كروماتوگرافي
• تعيين فسفاتها
1-5-2-آزمايشات ميکروبي
دستگاههاي آزمايشگاه ميکروبي، آون، 3 تا انکوباتور با دماهاي مختلف، هود باکتريولوژيکي، اتوکلاو، روش هاي سريع (rapid) (يکسري محيط کشتهايي است که تا 24 ساعت جواب ميدهد و با تغيير رنگ بستگي به نوع تغيير رنگ مشخص ميکند که سالمونلا، اشيرشيا و … وجود دارند.) ميباشد (Ellis, Broadhurst et al. 2002).
1-5-3-روش اندازه‏گيري رطوبت گوشت و فرآورده‏هاي آن
ظرف را كه حاوي 4-3 برابر وزن نمونه مورد آزمون شن است همراه با ميله بلوري به مدت نيم ساعت در اتوو 2 ± 103 درجه خشك كنيد و بگذاريد كه ظرف و محتويات آن در دسيكاتور تا درجه حرارت آزمايشگاه سرد شود و سپس با دقت يك ميليگرم آن را توزين كنيد. 10-5 گرم از نمونه آماده شده را به ظرف منتقل كرده و مجددا به دقت يك ميليگرم آن را توزين كنيد.
برحسب وزن نمونه 10-5 ميليليتر الكل اتيليك به ظرف اضافه كرده به وسيله ميله طوري مخلوط كنيد و آن را روي حمام آب كه درجه حرارت آن براي جلوگيري از بيرون انداختن قسمت‏هايي از نمونه بين 80-60 درجه تنظيم شده حرارت دهيد و گاهي بهم زنيد تا الكل تبخير شود. ظرف و محتويات آن را مدت 2 ساعت در اتوو كه در 2 ± 103 درجه تنظيم شده حرارت دهيد، سپس ظرف را از اتوو به دسيكاتور منتقل نماييد و آنگاه بگذاريد ظرف تا درجه حرارت آزمايشگاه سرد شود و سپس به دقت يك ميلي‏گرم آن را توزين كنيد. عمليات بالا را تكرار كنيد تا نتيجه دو توزين پشت سرهم كه با يك ساعت حرارت دادن از هم فاصله داشته باشند بيش از 1/0% وزن نمونه اختلاف نداشته باشد.
1-5-4-تعيين pH گوشت و فرآوردههاي آن
الکترود را داخل نمونه قرار مي دهند و سيستم تصحيح دماي pH متر را با دماي نمونه تنظيم مي نمايند. نمونه را با همزن بهم زده تا همگن شود و سپس با استفاده از pH متر، pH را اندازه شود. همچنين براي اندازه گيري PH در فرآورده هاي غيرهمگن، با يک کارد سوراخي در نمونه ايجاد نموده تا در موقع قرار گرفتن الکترود در آن موجب شکستگي نگردد. دماي نمونه را تنظيم نموده و سپس pH را با استفاده از pH متر اندازهگيري نماييد.
1-5-5-اندازه‏گيري پروتئين تام در گوشت و فرآورده‏هاي آن
در حدود 2 گرم از نمونه آماده شده را در كاغذ صافي كوچك و يا يك ورقه كوچك آلومينيومي كه قبلاً توزين شده به دقت 1/0 ميلي‏گرم توزين كرده و در داخل بالن هضم بياندازيد. سپس 20 ميلي‏ليتر اسيد سولفوريك غليظ و 8 گرم از مخلوط كاتاليزور (96 درصد سولفات پتاسيم و 5/3 درصد سولفات مس و 5/0 درصد اكسيد سلينوم) به آن افزوده و بالن را به دستگاه مخصوص هضم كلدال وصل كرده و حرارت دهيد. حرارت بايد در ابتدا ملايم بوده و پس از اين‏كه محتوي بالن ديگر كف نكرد حرارت را زياد كنيد و ‏گاهي بالن را به هم بزنيد. حرارت را آن‏قدر ادامه دهيد تا مواد آلي هضم شود و مايع تقريبا بي‏رنگي در ته بالن باقي بماند سپس حرارت را مدت 5/0 تا 1 ساعت ادامه دهيد. هرگاه ديواره بالن آلوده به نمونه باشد بايستي پس از سردشدن بالن هضم آن را با مقدار كم آب مقطر شسته تا تمام نمونه در ته بالن جمع شود سپس مجددا آن را حرارت داده تا مواد آلي كاملا هضم شود. بالن را بگذاريد سرد شود و سپس آن را با 400 ميلي‏ليتر آب مقطر در دفعات مكرر شستشو داده و از راه قيف مربوط به بالن تقطير به داخل آن بريزيد. عمل شستشوي بالن هضم را چندين مرتبه تكرار كنيد تا مطمئن شويد تمام قسمت هضم شده به بالن دستگاه تقطير وارد شده و چيزي از آن هدر نرفته باشد سپس چند قطعه سنگ جوش به آن بيفزاييد. در زير مبرد دستگاه تقطير يك ارلنماير محتوي 500 ميلي‏ليتري محتوي 50 ميلي‏ليتر محلول اسيدبوريك و چند قطره متيل قرمز قرار دهيد. دستگاه تقطير را با دقت نصب كنيد و توجه داشته باشيد كه شير آب مربوط به مبرد باز باشد و قسمت‏هاي مختلف دستگاه به طور محكم به هم مربوط باشند. سپس از راه قيف به مقدار كافي محلول سود 50% بيفزاييد تا محيط قليايي شود (حداقل 75 ميلي‏ليتر سود لازم است) بالن را حرارت دهيد و عمل تقطير را در حالي‏كه انتهاي مبرد در محلول اسيد بوريك قرار دارد ادامه داده تا تمام آمونياك موجود در ظرف گيرنده جمع شود.
در حدود 200 تا ميلي‏ليتر از محلول تقطير شده را جمع‏آوري نموده ابتدا شير قيف را باز كرده و سپس حرارت را قطع كنيد و انتهاي مبرد را از داخل محلول اسيد بوريك خارج كرده و پس از چند دقيقه تقطير آزاد حرارت را قطع كنيد و قسمت خارجي مبرد را با كمي آب مقطر به داخل ارلنماير بشوييد و محلول را به وسيله اسيد سولفوريک 1/0 نرمال تيتر كنيد. همين آزمايش را براي محلول شاهد انجام دهيد.
1-6-تکنيک هاي کاربردي در شناسايي گونه هاي گوشتي

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

علاوه بر تکنيک هاي کلي ذکر شده جهت کنترل کيفي عام فرآورده هاي غذايي، تکنيک هاي متعددي وجود دارند که مي توان از آن ها براي شناسايي گونه هاي استفاده شده در تهيه فرآورده هاي گوشتي استفاده نمود. مهمترين تکنيک هايي که در حال حاضر براي شناسايي گونه هاي گوشتي مي توان از آنها استفاده نمود در شکل 1-1 و مهمترين تکنيک هاي کاربردي براي شناسايي پروتئين گياهي سويا در شکل1-2 خلاصه شده است.
شکل 1-1-تکنيک هاي موجود براي شناسايي گونه هاي گوشتي
شکل 1-2-تکنيک هاي موجود براي شناسايي پروتئين گياهي سويا
1-6-1- تکنيک هاي مبتني بر پروتئين
مرحله اوليه براي بررسي پروتئين ها جداسازي پروتئين ها از نمونه ها است. از مهمترين و معتبرترين روش هاي جداسازي پروتئين ها مي توان به الکتروفورز و کروماتوگرافي اشاره نمود. الکتروفورز اولين بار توسط شيميدان سوئدي آرن تيسليوس ابداع شد. در سال 1937، تيسليوس روشي براي جداسازي الکتروفورتيک پروتئين هاي سرم ابداع کرد. انگيزه اصلي براي طراحي اين روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه اي مشهور شد، مشکلاتي بود که در حين بررسي پروتئين هاي سرم وجود داشت. تيسليوس براي اولين بار فراکنش هاي آلفا، بتا، و گاما را در سرم تشريح و نام گذاري کرد. وي به خاطر تحقيق بر روي الکتروفورز و آناليز جذبي، بخصوص اکتشافاتي که ماهيت پيچيده پروتئين هاي سرم را مشخص مي کرد، جايزه نوبل شيمي را در سال 1948 از آن خود کرد (Altria 1999). از ديگر روش هاي قديمي کروماتوگرافي است که خود داراي انواع مختلفي است که اولين نوع آن را مي توان کروماتوگرافي ژلي در نظر گرفت. اين نوع کروماتوگرافي براي اولين بار در سال 1954 معرفي و در سال 1959 اصلاح شد. در اين روش، جداسازي‌هايي مبتني بر الک کردن مولکولي بر روي اجسام بي‌بار در جريان مهاجرت الکترو اسمزي از داخل ژل‌ها انجام مي‌شود. بدين ترتيب که جداسازي بر مبناي اندازه‌هاي نسبي مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسيله ژل استفاده مي‌شود. ژل استفاده شده در اين روش بايد بي اثر و پايدار باشد. در ادامه پس از دهه 80 ميلادي با توجه به نياز به ابداع روش هاي جديد تجزيه تحليل پروتئين ها با دقت بسيار بالا بر اساس ساختار و عملكرد پروتئين و واكنش بين پروتئين ها جهت جداسازي، ‏شناسايي و تشخيص پروتئين هاي روش هاي فوق الذکر ارتقاء پيدا کردند كه شامل تكنيك هاي كاربردي نظير جدايي پروتئين محلول در آب به وسيله نشاسته، ‏پلي آكريل آميد يا الكتروفورز ژل آگارز‎ ‎، الكتروفورز دو بعدي، كروماتوگرافي مايع و کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا بود (Abramson, Moyer et al. 1942; Lopez 2007).
به طور کلي، در اغلب روش ‏هاي الکتروفروتيک مربوط به شناسايي گونه ها در گوشت خام، از پروتئين هاي سارکوپلاسمي استفاده مي شود که اين موضوع به ‏دليل دماي بالاتر دناتوراسيون و حلاليت بيشتر پروتئين هاي سارکوپلاسمي نسبت به ساير پروتئين ها مي باشد. از جمله روش هاي ديگر مبتني بر پروتئين ها که هيچ ارتباطي به استخراج پروتئين ها ندارد، استفاده از مطالعات بافت شناسي مي باشد که در آن پس از تهيه لام هاي بافتي، توسط آنتي بادي هاي منوکلونال اختصاصي يک پروتئين خاص هدف گيري شده و توسط ميکروسکوپ فلورسانس مورد مطالعه و بررسي قرار مي گيرد. اين روش نيز کاربرد فراواني در شناسايي منشأ بافتي و گونه اي نمونه هاي گوشتي دارد (Stamoulis, Stamatis et al. 2010; Soares, Amaral et al. 2013).
1-6-2- تکنيک هاي مبتني برDNA ‏‎ ‎
با توجه به زمانبر بودن و مشکلاتي که در روش هاي تشخيصي مبتني بر پروتئين وجود دارد، روش مبتني بر DNA بر پايه PCR به علت سادگي، اختصاصيت و ويژه بودن و حساسيت اين روش براي بررسي کيفيت و سلامت غذايي و تخمين ترکيبات غذايي مناسب تر است و مي تواند جانشين مناسب تري براي روش هاي ايمني شناسي موجود براي شناسايي گونه هاي گوشتي شود. مزيت ديگر PCR بر علاوه توانايي تمايز بين گونه هاي بسيار نزديک در غذاهاي ترکيبي و پيچيده مثل محصولات گوشتي ماريناد شده و حرارت دهي شده ، حتي مي تواند براي تمايز منشأ بافتي درون گونه اي نيز استفاده شود (Meyer, Chardonnens et al. 1996).
تکنيک PCR با توجه به حساسيت ويژه و توانايي کابرد حتي در مقادير بسيار اندک در محصولات خام و فرآوري شده و سرعت باعث مي شود که روش هاي تکثير DNA در بازبيني و بررسي موادغذايي، شناسايي مواد غذايي اصلاح ژنتيک شده و شناسايي تقلبات در فرآورده هاي غذايي کاربرد فراواني داشته باشند (Mafra, Silva et al. 2008).
1-6-2-1-واکنش زنجيره پليمراز (PCR)
1-6-2-1-الف-اطلاعات اوليه
اين روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغييرات حرارت مي‌توان چندين فرآيند را به دنبال همديگر انجام داد. با اين تکنيک مي‌توان به عنوان يک روش قدرتمند تشخيص باليني (Diagnostic) براي وجود موتاسيون‌ها در ژنوم انساني، يا براي وارد کردن جهش‌هاي ويژه به داخل ژن همسانه شده، استفاده کرد. PCR بطور دستي و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌هاي آزمايش بين حمام‌هاي آب داراي دماي لازم، بوجود آمد. امروزه دستگاه هايي بطور تجارتي تهيه مي‌شوند که در آن ها جايگاه هاي لوله‌اي با بلوک فلزي حرارت پذير تعبيه شده است و قابل برنامه ريزي براي تغيير سريع بين دماهاي لازم است (Eckert and Kunkel 1991).
1-6-2-1-ب-تاريخچه
در گذشته معمولا از روش هاي شيميايي براي توليد قطعات نوکلئوتيدي استفاده مي‌کردند، اما اين روش ها پر زحمت بوده و نياز به مدت زمان طولاني داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمايشگاه هاي زيست شناسي مولکولي استفاده مي‌شود (Arnheim and Erlich 1992).
1-6-2-1-ج-مراحل PCR
مرحله دناتوراسيون:
DNA در مرحله اول براي مدت کوتاهي (30 ثانيه) قطعات DNAرا در درجه حرارت 94 درجه سانتي گراد حرارت مي‌دهند تا دو زنجيره DNA از هم باز نشود.
مرحله آغازگر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتيدي:

اين قطعات معمولاً از 25-18 باز آلي تشکيل مي‌شوند و مي‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روي ژن مورد نظر قرار دارند، اتصال يابند. قطعه‌اي که در آن PCR به تعداد زياد ساخته مي‌شود، در واقع ما بين دو آغازگر قرار دارد. مرحله اتصال آغازگرها کوتاه بوده و حدوداً 30 ثانيه در دماي 65-30 درجه سانتيگراد صورت مي‌گيرد.
مرحله پليمريزاسيون يا مرحله سنتز:
در اين مرحله با دخالت آنزيم DNA پليمر از بر روي رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتيد تري فسفات‌هايي که در محلول وجود دارند، صورت مي‌گيرد و براي سنتز DNA هميشه يک رشته DNA به صورت الگو و يک قطعه پلي نوکلئوتيدي به عنوان آغازگر مورد نياز است. مراحل کلي PCR در شکل 1-3 شنان داده شده است.
ادامه PCR بعد از چرخه اول:
بعد از اين 3 مرحله ، چرخه اول تمام مي‌شود، چرخه‌هاي بعدي تکرار چرخه اول است. بدين صورت به دنبال چرخه‌هاي متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدي افزايش مي‌يابد. يعني از 20 چرخه، ژن مورد نظر داراي بيش از 250 هزار خواهد بود. بنابراين روش PCR روش کارا در ازدياد يک قطعه از DNA است (Innis, Gelfand et al. 1990).
شکل1-3-مراحل مختلف تکنيک PCR


پاسخ دهید