3-4-1- RT-PCR37
3-4-2- تکثير cDNA39
3-4-2-1- PCR(Polymerase Chain Reaction)39
3-4-2-2- مواد و وسايل مورد نياز براي ساخت CDNA43
3-4-2-3- روش انجام آزمايش ساخت cDNA44
3-4-2-4- نحوه انجام واكنش RT-PCR براي اطمينان از صحت سنتز cDNA45
3-4-2-5- آشکار سازي محصولات PCR با الکتروفورز47
3-4-2-6- دستگاههاي مورد نياز براي الکتروفورز47
3-4-2-7- مواد لازم براي الکتروفورز47
3-4-2-8- نحوه انجام الکتروفورز48
3-4-2-9- آشکار سازي ژل48
3-5- Real time PCR49
3-5-1- موارد استفاده از Real-time PCR49
3-5-2- فازهاي مختلف يك واكنش Real time PCR50
3-5-3- روش‌هاي سنجش با Real-time PCR51
3-5-3-1- روش غير اختصاصي سنجش با Real-time PCR51
3-5-4- مفهوم Threshold وCt52
3-5-5- نحوه رسم منحني ذوب (Melt Curve Analysis)53
3-5-6- نحوه انجام Real time PCR55
3-5-6-1- مواد لازم براي انجام Real time PCR55
3-5-6-2-روش انجام آزمايش Real time PCR55
3-5-6-3- آناليز آماري 57
3-6-اندازه گيري ?-Amylase در سرم موش:57
3-6-1- جداسازي سرم از خون موش57
3-6-2- اندازه گيري ?-Amylase در سرم روش فتومتريک57
فصل چهارم نتايج60
4-1- مشاهدات افزايش وزن موش هاي گروه تست61
4-2- تعيين کيفيت و غلظت RNA استخراج شده66
4-3- بررسي کيفيت cDNA سنتز شده به وسيله PCR67
4-4-آناليز منحني ذوب (Melt Curve Analysis)68
4-4-1- مقايسه بيان ژن liver alpha amylase در موش هاي چاق و نرمال70
4-4-2-اثر چاي سبز بر بيان ژن liver alpha amylase بر روي موش هاي چاق71
4-5- اندازه گيري آلفا آميلازدر سرم به روش فتومتريک72
فصل پنجم : بحث و نتيجه گيري73
5-1- بحث و نتيجه گيري74
5-2-پيشنهادات81
منابع83
خلاصه انگليسي92
عنوان فهرست جداول صفحه
جدول 3-1-رژيم غذايي پر چرب29
جدول 3-2-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA44
جدول 3-3-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتزcDNA44
جدول 3-4-غلظت مواد استفاده شده در واکنش سنتز cDNA45
جدول 3-5-توالي پرايمرها براي تکثير قطعه مورد نظر داراي ژن آلفا آميلاز کبدي45
جدول 3-6 مواد لازم براي انجام واکنش RT PCR46
جدول 3-7-مواد لازم براي Real time PCR55
جدول 3-8-پرايمرهاي مورد استفاده براي Real time PCR56
جدول 3-9-مقادير لازم براي انجام تست سنجش آلفا آميلاز59
جدول 4-1-تغييرات وزن موش ها تحت رژيم غذايي متفاوت61
جدول 4-2-ميزان جذب نور توسط DNA در طول موج هاي 260 و 280 نانومتر67
عنوان فهرست نمودارها صفحه
نمودار 3-1-فازهاي مختلف واکنش تکثير51
نمودار 3-2-Cycle threshold&Threshold53
نمودار 3-3-منحني ذوب54
نمودار 3-4-مراحل مختلف انجام واکنش Real time PCR56
نمودار 4-1-تغييرات وزن موش ها کنترل تيمار و کنترل عادي64
نمودار 4-2-تغييرات وزن موش ها کنترل تيمار و کنترل عادي64
نمودار 4-3-تغييرات وزن موش ها چاق تيمار و چاق عادي65
نمودار 4-4-تغييرات وزن موش ها چاق تيمار و چاق عادي65
نمودار 4-5-منحني تکثيرژن آلفا آميلاز کبدي69
نمودار 4-6-منحني ذوب ژن آلفا آميلاز کبدي69
نمودار 4-7-متوسط ميزان تغييرات بيان ژن آلفا آميلاز کبدي در موش هاي چاق عادي و کنترل عادي70
نمودار 4-8-متوسط ميزان تغييرات بيان ژن آلفا آميلاز کبدي در موش هاي چاق عادي و چاق کنترل71

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

نمودار 4-9-تغييرات آميلاز در سرم موش هاي چاق و نرمال بر حسب IU/ml به روش فتومتريك72
عنوان فهرست اشکال صفحه
شکل2-1-نمايي شماتيک از آلفا آميلاز يون کلسيم به رنگ خاکي و يون کلريد به رنگ سبز است11
شکل2-2-ساختار کريستالي آلفا آميلاز جو ايزوآنزيم 116
شکل2-3-جايگاه ژن آميلاز روي ژن 1p2117
شکل2-4-اين شکل تکامل ژن آميلاز انساني را نشان مي دهد19
شکل2-5-توالي اي که بعنوان عامل تفاوت در سايز بين mRAN آلفا آميلاز کبدي و غدد بزاقي20
شکل2-6-مقايسه شماتيکي از mRAN آلفا آميلاز کبدي و بزاقي21
شکل3-1-پلت آزمايشگاهي30
شکل3-2-مراحل خونگيري از قلب موش32
شکل3-3-مراحل جداسازي کبد موش33
شکل3-4- غلظت مواد استفاده شده در Master mix استفاده شده در PCR46
شکل3-5-اتصال SYBR به DNA52
شکل4-1-تصوير باند حاصل از RNA استخراج شده67
شکل4-2-صوير محصولات PCR چند نمونه که به صورت تصادفي انتخاب شده بودند68
فهرست اختصارات
VLN under limit normal
LTR long terminal repeat
NTE non translated exon
EGCG (-)-epigallocatechin-3-gallat
OD optical density
NTC no template control
PCR polymerase chain reaction
FRET fluorescence resonance energy transfer
CT cycle threshold
Tm melting temperature
HPRT hypoxanthine quinine phosphoribosyl transferase
WHO world health organization
چکيده:
مقدمه و اهداف
آلفا آميلاز آنزيمي از راسته هيدرولازها است که پيوندهاي 1به4 آلفا گليکوزيدي در پلي ساکاريدها را کاتاليز مي کند و يکي از مهمترين آنزيم هاي گوارشي است. استفاده از مهارکننده هاي آلفا آميلاز (مانند چاي سبز) مي تواند در کنترل وزن مفيد باشد، بنابراين مقايسه ميزان بيان ژن آلفا آميلاز کبدي بين موش هاي چاق و نرمال و تاثير مهار کننده هاي آنزيم در ميزان بيان ژن مي تواند به مطالعات درماني چاقي و سندرم متابوليک کمک نمايد.
مواد و روش ها
موش ماده NMRI (6 هفته اي) به طور تصادفي به 4 گروه (8=n)تقسيم شدند. گروه اول موش هاي نرمال بودند که تحت هيچ تيماري قرار نگرفته بودند. گروه دوم موش هاي نرمال بودند که عصاره ي آبي الکلي چاي سبز (به ميزان 2/0 ميلي گرم) مصرف کرده بودند. گروه سوم موش هايي بودند که رژيم غذايي پر کالري دريافت کرده بودند وگروه چهارم موش هايي بودند که علاوه بر اين که رژيم غذايي پر کالري دريافت کرده بودند در اين مدت از عصاره ي آبي الکلي چاي سبز هم (به ميزان 2/0 ميلي گرم) دريافت کرده بودند. طي 8 هفته، در 4 گروه وزن بدن به صورت هفتگي اندازه گيري شدو پس از پايان دوره بافت کبدي جدا شده و بيان آلفا آميلاز کبدي اندازه گيري شد. پس ازجداسازي RNA و سنتزcDNA،Real time -PCR با پرايمر اختصاصي براي ژن Amy-1 ژن انجام شد.

نتايج
متوسط تغييرات بيان ژن آلفا آميلاز کبدي در موش هاي چاق عادي در مقايسه با موش هاي کنترل عادي افزايش يافته، و اين افزايش از لحاظ آماري معني دار است (P value?0.01).همچنين متوسط تغييرات بيان ژن آلفا آميلاز کبدي در موش هاي چاق تيمار در مقايسه موش هاي چاق عادي کاهش يافته، واين کاهش هم از لحاظ آماري معني دار است ( P value?0.04). لذا مي توان گفت مصرف هم زمان چاي سبز با رژيم غذايي پر کالري اثر کاهنده بر روند افزايش بيان ژن آلفا آميلاز کبدي دارد.
واژه گان کليدي : آلفا آميلاز، کبد، بيان ژن، چاقي،چاي سبز
فصل اول: کليات
1-1-بيان مسئله
چاقي به عنوان يک خطر بزرگ براي سلامت انسان شناخته مي شود. چاقي مي تواند خطر ابتلا به بيماري هاي قلبي و عروقي (به طور عمده بيماري قلبي و سکته مغزي)، ديابت نوع 2، اختلالات اسکلتي عضلاني (به خصوص آرتروز) و انواع خاصي از سرطان (آندومتر، پستان و روده بزرگ) را افزايش دهد (74).
عموما کربوهيدرات ها يکي از اجزاي اصلي تشکيل دهنده رژيم غذايي مي باشند . کربوهيدرات ها قبل از اينکه توسط بدن جذب شوند بايد به مونوساکاريدها شکسته شده باشند. اين تجزيه با استفاده از دو آنزيم رخ مي دهد: آميلاز و گلوکوزيداز(55).
بنابر اين جستجو براي يافتن مهار کننده قوي و کاربردي آلفا گلوکوزيداز و آلفا آميلاز به عنوان ابزاري براي درمان چاقي مطرح شده و در حال حاضر تبديل به کانوني براي پژوهش گرديده است.تا به حال مهار کننده هاي مختلفي براي آلفا آميلاز شناسايي شده است که از آنها مي توان به فلاونوئيد ها اشاره کرد که از جمله آنها مي توان به کاتچين ها اشاره کرد. کاتچين ماده موثره چاي سبز مي باشد (65). لذا احتمال دارد چاي سبز نقش مهاري براي بيان ژن آلفا آميلاز داشته باشد.
در اين تحقيق قصد بر آن بوده است که از عصاره ي چاي سبز به عنوان مهارکننده بالقوه بيان ژن آلفا آميلاز کبدي در موش ها استفاده شود. استفاده از مهارکننده هاي آلفا آميلاز(چاي سبز) مي تواند در کنترل وزن مفيد باشد، بنابراين مقايسه ميزان بيان ژن آلفا آميلازکبدي بين موش هاي چاق و نرمال و تاثير مهار کننده هاي آنزيم در ميزان بيان ژن مي تواند به مطالعات درماني چاقي و سندرم متابوليک کمک نمايد.
1-2-اهداف پژوهش
بررسي ميزان بيان ژن آلفا آميلاز کبدي به روش Real time PCR در بافت کبد موش هاي نرمال و چاق
– بررسي اثر چاي سبز بر روند چاقي موش هاي چاق و نرمال
1-3-فرضيات اصلي پژوهش
– عصاره ي چاي سبز اثر بازدارنده بر روند چاقي موش هاي چاق دارد.
– بيان ژن آلفا آميلاز در کبد موش هاي چاق بيشتر از موش هاي نرمال است.
– بيان ژن آلفا آميلاز در کبد موش هاي چاق تيمار شده با چاي سبز نسبت به موش هاي چاق غير تيمار کمتر است.
– بيان ژن آلفا آميلاز در کبد موش هاي نرمال تيمار شده با چاي سبز نسبت به موش هاي نرمال غير تيمار کمتر است.
1-4- جنبه جديد بودن و نوآوري در تحقيق:
در کليه مقالات مطالعه شده اثر چاي سبز بر روي فعاليت آنزيم مورد بررسي قرار گرفته است در صورتي که قصد اين پژوهش مطالعه اثر عصاره ي آبي و متانولي چاي سبز بر بيان ژن آلفا آميلاز کبدي به روش Real time PCR در موش چاق و نرمال است.
فصل دوم: مروري بر مطالعات گذشته
2-1-آميلاز:
آميلاز آنزيمي است که باعث تجزيه نشاسته به قند مي باشد. آميلاز موجود در بزاق انسان اولين فرآيند شيميايي هضم را آغاز ميکند. غذاهايي که حاوي مقادير بالايي نشاسته اما قند بسيار کم هستند مانند برنج و سيب زميني، هنگام جويده شدن در دهان، کمي طعم شيرين دارند زيرا آميلاز در دهان نشاسته را به قند تبديل مي کند. همچنين آميلاز موجود در پانکراس باعث مي شود نشاسته موجود در رژيم غذايي به دي ساکاريد ها و تري ساکاريدهاي هيدروليز شوند که توسط آنزيم هاي ديگر براي تامين انرژي بدن به گلوکز تبديل مي شود. گياهان و برخي از باکتري ها نيز آميلاز توليد مي کنند (26).
2-1-1- تاريخچه:
لاچس در سال 1831، هيدروليز نشاسته به آميلاز را در بزاق به علت وجود آنزيمي در بزاق به نام ptyalin يا ماده تخميري بزاق شرح داد (38). پايان و پرسوز شيميدانان فرانسه در سال 1833 مجموعه آميلاز را از جوانه جو جدا کردند و آن را “دياستاز” ناميدند(53) و در سال 1862، جکولوويتچ آميلاز پانکراس را شناسايي کرد (14).
2-1-2- آميلاز در تکامل دستگاه گوارش انسان:
کربوهيدرات ها منبع غذايي غني انرژي هستند. آميلاز يک نقش کليدي در تکامل دستگاه گوارش انسان داشته است چرا که امکان استفاده از يک جايگزين براي ميوه و پروتئين را به انسان داده است. کپي برداري از ژن آميلاز پانکراس به طور مستقل در انسان و جوندگان توسعه يافته است، که اهميت بالاي اين آنزيم را نشان مي دهد. سطح آميلاز بزاقي که در تبار انسان يافت مي شوند، شش تا هشت برابر بيشتر از شامپانزه است، که عمدتا ميوه خوارند ونسبت به انسان کمتر مواد نشاسته اي مصرف مي کنند(72).
2-1-3- کارکردهاي آميلاز :
آميلاز موجب شکستن قندهاي پيچيده از قبيل نشاسته موجود در آرد به قندهاي ساده مي شود. مخمر ها سپس بر روي اين قندهاي ساده واکنش انجام مي دهند و آن را به الکل و CO2 تبديل مي کنند. اين محصولات باعث افزايش عطر و طعم نان نسبت به برنج مي شوند. در حالي که آميلاز به طور طبيعي در سلول هاي مخمر يافت مي شود، زماني طول مي کشد تا مخمر به ميزان کافي از اين آنزيم براي شکستن مقادير قابل توجهي از نشاسته در نان ، توليد کند. يکي ازدلايل براي استفاده خمير ترش در پخت نان همين موضوع است. درتکنيک هاي مدرن توليد نان از آميلاز (که اغلب به صورت جو مالت شده است) به عنوان بهبود دهنده نان استفاده مي کنند، تا فرآيند پخت نان براي استفاده تجاري سريع تر و عملي تر شود(44).
زماني که آميلاز به عنوان يک افزودني غذايي استفاده مي شود،) آميلاز شماره (E1100، ممکن است از لوزالمعده خوکي يا قارچ مشتق شده باشد. آميلاز باکتريايي 1 نيز درپودر لباس شويي و مواد شوينده ماشين ظرفشويي براي انحلال نشاسته از پارچه و ظروف استفاده مي شود.
کارگران کارخانه که با آميلاز براي هر يک از کاربردهاي فوق کار مي کنند، در معرض افزايش خطر ابتلا به آسم شغلي هستند. 5 تا 9 درصد نانوا ها تست پوستي مثبت درمورد آميلاز دارند ، و يک سوم تا يک چهارم مشکلات تنفسي نانواها به خاطر حساسيت به آميلاز است (43).
يکي از مهار کننده هاي آلفا آميلاز به نام فاسئولامين2، به عنوان يک کمک کننده بالقوه در رژيم غذايي يافت شده است (69).
آميلاز سرم خون ممکن است براي مقاصد تشخيص طبي اندازه گيري شود. غلظت طبيعي آن در محدوده (U/L101-21) است. وجود آميلاز بالاتر از غلظت نرمال ممکن است منعکس کننده بيماري هايي نظير التهاب حاد پانکراس (اگرهمزمان با ليپاز باشد مشخص تر است)(18)، زخم معده حاد، کيست تخمدان، انسداد روده کوچک و اوريون باشد. آميلاز ممکن است در ساير مايعات بدن، از جمله ادرار و مايع صفاقي اندازه گيري شود(9).
در زيست شناسي مولکولي، حضور آميلاز مي تواند به عنوان يک روش کمکي ديگري براي انتخاب يکپارچه سازي موفق از سازه گزارشگر علاوه بر مقاومت به آنتي بيوتيک استفاده شود مناطق همولوگ از ژن ساختاري آميلاز به عنوان ژن گزارشگر عمل مي نمايند ،در صورت موفق بودن ادغام ژن مورد نظر ؛ ژن آلفا آميلاز تخريب شده و از تجزيه نشاسته جلوگيري مي شود که اين امر به راحتي از طريق رنگ آميزي يد قابل تشخيص است(9).
آميلاز در بدن انسان در بزاق، آنزيمهاي لوزالمعده و روده باريک يافت مي شود. اين آنزيم باعث تجزيه زنجيره هاي پلي ساکاريد مانند نشاسته به اجزاي کوچکتر و دي ساکاريدهايي مانند مالتوز مي شود و نقش مهمي در هضم کربوهيدراتها دارد.ساير بافتها نيز تا حدودي فعاليت آميلازي دارند که در اين باره مي توان به اندام هايي چون تخمدان ها ، روده کوچک و بزرگ و عضلات مخطط اشاره کرد(9).
آلفا آميلاز موجود در بزاق کمي از نشاسته را تجزيه مي کند چون مدت توقف غذا در دهان ناچيز است ولي قسمت عمده فعاليت اين آنزيم مربوط به آميلاز پانکراس است. آميلاز به طورطبيعي از سلول هاي آسينار پانکراس به مجراي پانکراس وسپس دوازدهه ترشح مي گردد و در روده به تجزيه نشاسته کمک مي کند (9).
هضم نشاسته طي مراحل مختلفي در انسان انجام مي شود. در ابتدا آلفاآميلازهاي بزاقي يک هضم جزئي انجام مي دهند، که سبب شکستن نشاسته پلي مريک به اليگومرهاي کوچکتر مي شود. به محض اينکه اين نشاسته کمي هضم شده به روده مي رسد، توسط آلفاآميلاز پانکراسي بطور گسترده اي به اليگوساکاريدهاي کوچکتر هضم شده، به درون لومن ترشح مي شود. مخلوط حاصل، از اليگوساکاريدها حاوي مالتوز، مالتوتريوز و تعدادي اليگو- گلوکانهاي آلفا 1به4 و آلفا 1به6 مي باشد. سپس اين مخلوط از خلال لايه موکوسي به غشاي پوشيده از ميکروويلي سلولهاي روده مي رسد. در اين نقطه تعدادي از آلفاگلوکوزيدازها تجزيه بيشتر اين اليگوساکاريدها را تا به دست آمدن گلوکوز انجام خواهند داد. سپس اين گلوکوز جذب شده، با يک سيستم انتقالي خاص وارد جريان خون مي شود(61).
2-1-4- ساختار آميلاز:
آميلازها ساختاري پروتئيني دارند و به سه زير گروه آلفا آميلاز (?-Amylase) ، بتا آميلاز (?-Amylase) و گاما آميلاز (?-Amylase) تقسيم بندي مي شوند. عمل هيدروليز آلفا آميلاز مرتب نبوده و در قسمت هاي مختلف زنجيره اثر مي کند و بتا آميلاز زنجيره هاي پلي ساکاريدي مانند نشاسته و گليکوژن را از قسمت انتهايي احيا کننده ي آنها هيدروليز مي کند و هربار يک مولکول مالتوز به وجود مي آورد و
گاما آميلاز هم در واقع شبيه آلفا آميلاز است ولي از نوع ليزوزمي آن که تفاوت اصلي آن با دو نوع ديگر آميلاز کارآمدي آن در محيط هاي اسيدي است. دو ايزوآنزيم عمده آميلاز مربوط به پانکراس (p) وغدد بزاقي (s) است. pH مطلوب براي اين آنزيم حدود ? مي باشد .يون هاي کلر، برم و نيترات آن را فعال وسيترات و اگزالات آن را مهار مي کنند. در واقع آنزيم آميلاز نشاسته رااز محل پيوندهاي 1به4 هيدروليز مي کند. آن را به مالتوز تبديل مي کند(9).
2-1-5- اندازه گيري سطح خوني:
سطح خوني اين آنزيم در آسيب سلولهاي پانکراس در بيماري پانکراتيت و ساير بيماري هاي پانکراس مانند انسداد مجاري پانکراس در خون افزايش مي يابد. بنابراين در موارد وجود علائم مربوط به بيماريهاي پانکراس مانند درد شديد شکمي، تب، کاهش اشتها و استفراغ اين تست درخواست مي شود(9).
آسيب سلول هاي آسينار پانکراس ، التهاب يا انسداد در مجاري پانکراس يا مجراي صفراوي سبب برگشت آميلاز به داخل بافت پانکراس مي شود. سپس آميلاز از طريق وريدچه ها وعروق لنفاوي جذب خون مي گردد و سبب افزايش سطح آميلاز در خون مي شود. کليه به سرعت آميلاز را تصفيه مي کند و در نتيجه سطح آميلاز در ادار افزايش مي يابد. سطح افزايش يافته ي آميلاز در خون هيپرآميلازي ناميده مي شود. براي مثال در پانکراتيت حاد، مقدار آميلاز سرم در مدت ??-? ساعت شروع به افزايش مي کند در مدت ??-?? ساعت به اوج مي رسد و در عرض ?-? روز به علت تصفيه آن توسط کليه ها به وضعيت طبيعي مي گردد. در واقع سطح آميلاز سرم ?-? روز بعد از بهبود مرحله ي حاد بيماري به حد طبيعي برمي گردد اما در سطح آميلاز ادرار ?-? روز پس آغاز بيماري بالا باقي مي ماند اين امر به تشخيص پانکراتيت پس از بازگشت سطح سرمي آن به حالت طبيعي کمک مي کند. آزمون آميلاز ادرار و سرم هر دو آزمون هاي حساسي هستند اما براي اختلالات پانکراس اختصاصي نيستند، ساير بيماري هاي غير پانکراسي هم مي توانند سطح آميلاز را در سرم وادرار بالا ببرند. براي مثال در التهاب حاد غدد پاروتيد مانند اوريون و نيز در انفارکتوس کليه، بارداري خارج رحمي، انسداد روده، ايسکمي مزانتر و اختلالات وخيم روده اي هم مقدار آميلاز افزايش مي يابد پس بايد علاوه بر آن آزمون ها به علايم بيماري هم توجه ويژه داشت(9).
در افراد مبتلا به موکوويسيدوز که يک بيماري مادر زادي پانکراس است سطوح آميلاز سرم کاهش مي يابد.افزايش آميلاز خون به همراه کاهش يا نرمال بودن آميلاز ادرار مي تواند مطرح کننده اختلال در عملکرد کليه و يا حضور ماکروآميلاز (آميلاز باند شده به پروتئينهاي خون) در خون باشد که اين وضعيت آخر نمي تواند مطرح کننده بيماري خاص باشد(9).
در پانکراتيت حاد معمولاً افزايش آميلاز ، همسو با افزايش آنزيم ديگري به نام ليپاز مي باشد و اغلب در تشخيص اين بيماري اندازه گيري هر دو آنزيم با يکديگر در خواست مي شود ولي در پانکراتيت مزمن که معمولاً به دليل الکليسم و يا ناهنجاري هاي ژنتيکي مانند سيستيک فيبروزيس اتفاق مي افتد ميزان آميلاز به صورت متوسط افزايش مي يابد و يا در موارد آسيب و از بين رفتن سلولهاي سازنده آميلاز ميزان اين آنزيم کاهش مي يابد.در اندازه گيري آميلاز بايد توجه داشت که داروهايي مانند آسپيرين، ضد بارداري هاي خوراکي، استروئيدها مانند کورتيکوستروئيدها، ايندومتاسين و همچنين داروهاي مدر باعث افزايش آميلاز مي شود(9).
2-2- آلفا آميلاز:
آلفا آميلاز (EC 3.2.1.1) نوعي آنزيم است که اتصالات آلفاي پلي ساکاريد هاي بزرگ داراي پيوند آلفا، مانند نشاسته و گليکوژن را به گلوکز و مالتوز هيدروليز مي کند(45). آلفا آميلاز بيشترين فرم آميلاز موجود در انسان ها و پستانداران مي باشد. البته آلفا آميلاز در بعضي دانه هاي گياهي حاوي نشاسته حضور دارد و توسط بسياري از قارچ ها هم ترشح مي شود(71).
آلفا آميلاز يک متالوآنزيم است که حداقل داراي يک يون Ca2+ مي‌باشد و بدون حضور کلسيم نمي‌تواند به طور کامل فعال باشد. تعداد يون Ca2+ از يک تا ده متفاوت است(41). (شکل2-1)
3شکل 2- 1- نمايي شماتيک از آلفا آميلاز يون کلسيم به رنگ خاکي و يون کلريد به رنگ سبز است.
2-2-1-کارکرد آلفاآميلاز :
آلفاآميلاز زنجيره کربوهيدراتي نشاسته را در مکان‌هاي تصادفي هيدروليز کرده و توليد اليگوساکاريدهاي کوتاه، مالتوز و گلوکز مي‌کند. اين واکنش بوسيله افزايش ميزان قندهاي احيا و کاهش رنگ آبي و يا از طريق تست برنفلد و توليد رنگ زرد قهوه‌اي در کمپلکس يد و نشاسته پايش مي‌شود. براساس سيستم طبقه‌بندي که براساس شباهت توالي آمينو اسيدي طراحي شده است اکثر آنزيم‌هاي تجزيه کننده نشاسته از جمله آلفا آميلازها در خانواذه ?? گليکوزيل هيدرلازها قرار مي‌گيرند. آلفا آميلازها داراي چهار ناحيه حفاظت شده در توالي اوليه خود مي‌باشند، برخي از اين نواحي حفاظت شده مربوط به جايگاه فعال‌اند و برخي در پايداري ساختار سوم حفاظت شده نقش دارند. آلفا آميلازها داراي يک ساختار8?/?))يا4 TIM barrel (بشکه?/?) مي‌باشند. يک سري قوس‌هاي ?-?-? طوري آرايش مي‌يابند که نتيجه آن ايجاد يک ساختمان پايدار مي‌باشد، اين موتيف را بشکه?/? مي‌نامند(9).
آلفا آميلاز يک آنزيم القاپذير است که معمولاً در حضور نشاسته و محصولات هيدروليزي نشاسته مانند مالتوز القا مي‌شود. آلفا آميلاز همانند ساير آنزيم‌هاي القاپذير در حضور گلوکز و ساير قندها تحت تاثير مهار کاتابوليک قرار مي‌گيرد(9).
2-2-2- آلفا آميلاز در فيزيولوژي انسان:
اگرچه آميلاز در بسياري از بافت هاي بدن يافت مي شود اما عمدتا در بزاق و مايع پانکراس (لوزولمعده) به وفور يافت مي شود که هر يک داراي ايزوفرم آلفا آميلاز انساني مخصوص خود مي باشند. آنها در فشار ايزوالکتريکي رفتار هاي متفاوتي دارند ، و همچنين مي توانند در آزمايش با استفاده از آنتي بادي مونوکلونال جدا شوند. در انسان، همه ايزوفرم هاي آميلاز مرتبط به کروموزوم 1p21 مي باشند (67).
2-3- آميلاز بزاقي يا ptyalin :
آميلاز در بزاق يافت مي شود و نشاسته را به مالتوز و دکسترين مي شکند. اين شکل از آميلاز “ptyalin”يا “ماده تخميري بزاق” نيز ناميده مي شود(44). اين آنزيم در بزاق مولکول هاي بزرگ و غير حلال نشاسته را به نشاسته ي حلال (آميلودکسترين، اريترودکسترين و آکرودکسترين) مي شکند، که منجر به توليد قطعات کوچکتر از نشاسته و در نهايت مالتوز مي گردد. Ptyalin بر اتصالات خطي ? 1)به(4 گليکوزيدي عمل مي کند اما هيدروليز کامل ترکيب نيازمند آنزيم اثر کننده بر ترکيبات شاخه دار مي باشد. آميلاز بزاقي در معده توسط اسيد معده غير فعال مي گردد. pH مايع معده حدود 3/3 است و ptyalin بمدت 20 دقيقه در درماي °C37 کاملا غير فعال مي شود(17).
2-3-1- تنوع ژنتيکي در آميلاز بزاقي:
ژن آميلاز بزاقي در طول تکامل تحت تکثيرقرار گرفته، و مطالعات هيبريداسيون DNA نشان مي دهد که افراد بسياري داراي چندين تکرار پشت سر هم ژن مي باشند. تعداد کپي هاي اين ژن مرتبط با ميزان هاي آميلاز بزاقي مي باشند که با استفاده از تکنيک هاي وسترن بلاتينگ و آنتي بادي هاي مخصوص آميلاز انساني اندازه گيري شده اند(78).
2-4- آلفا آميلاز پانکراس:
آلفا آميلاز پانکراس به طور تصادفي اتصالات خطي ? 1)به(4 گليکوزيدي آميلوز را مي شکند که نهايتا محصول آن دکسترين، مالتوز يا مالتوتريوز مي باشد(9).
2-5- آلفا آميلاز در پاتولوژي:
آزمايشات پزشکي معمولا هم آميلاز پانکراسي و هم آميلاز کل را اندازه گيري مي کنند. انجام تست مربوط به بررسي آميلاز در مقايسه با ليپاز آسان تر است.از آنجايي که ميزان موجود اين آنزيم در خون کم است، زمان تست هنگام گرفتن نمونه خوني براي اين اندازه گيري بسيار حياتي مي باشد. خونگيري بايد بلافاصله (سريعترين زمان ممکن) پس از درد پانکراسي گرفته شود در غير اين صورت به سرعت توسط کليه ها دفع مي شود.آلفا آميلاز بزاقي به عنوان بيومارکري براي تشخيص استرس استفاده مي شود که نيازي به خون گيري ندارد(9).
2-5-1- تفسير ميزان آلفا آميلاز:
افزايش ميزان پلاسمايي آلفا آميلاز در انسان در موارد زير يافت مي شود:
تروماي بزاقي (شامل لوله گذاري بيهوشي)
اوريون – به دليل التهاب غدد بزاقي
پانکراتيت – به دليل صدمه به سلول هاي توليد آميلاز
نارسايي کليوي – به علت کاهش دفع
استرس
خواندن آميلاز نهايي بالاي 10 برابر از محدوده ي نرمال (ULN5) احتمالا به دليل بيماري پانکراس يا پانکراتيتيس مي باشد. 5 تا 10 برابر ميزان طبيعي ممکن است نشان دهنده 6ايلئوس يا بيماري اثني عشر و يا نارسايي کليوي باشد، و ميزان کمتر از نرمال، عموما در بيماري هاي غدد بزاقي يافت مي شود (63و4و13).
2-6- بافر محدود کننده آلفا آميلاز:
مولکول تريس به عنوان مهار کننده تعدادي از ?-آميلاز هاي باکتريايي گزارش شده است(20و2)، از اين رو بهتر است در زمان انجام مطالعه يا به کاربردن آنزيم از بافر تريس استفاده نشود.
2-7- مطالعه فعاليت آنزيم:
بسياري از روشهاي اندازه گيري فعاليت آلفا آميلاز براي بررسي آنزيم موجود در مايعات بدن يا عصاره هاي برگرفته از دانه هاي گياهي طراحي شده است.
روشهاي رنگ سنجي بر اساس اندازه گيري رنگ آبي نشاسته – يد است که توسط فووا در دهه پنجاه ميلادي ابداع شد تا آن زمان تمام متدهاي اندازه گيري آميلاز در يکي از اين سه روش خلاصه مي شد؛ يدومتريک، ساکاروژنيک و ويسکومتريک(19).
2-7-1- روشهاي اندازه گيري فعاليت آلفاآميلاز تا قبل از روش رنگ سنجي:
در روش يدومتريک ، فعاليت آميلاز به صورت زمان لازم براي يک نمونه آنزيم مجهول جهت تبديل سوبستراي بيرنگ از محلول آبي کمپکس نشاسته- يد، بيان مي شود. اين روش زياد قابل اعتماد نبود زيرا غلظت آنزيم با کاهش رنگ رابطه خطي نداشت، همچنين رنگ آبي تحت تأثير دما و عوامل ديگر پايداري خود را از دست مي داد(73).
روش ساکاروژنيک بر اساس اندازه گيري گروههاي احياکننده توليد شده در اثر عمل هيدروليز نشاسته طراحي شده بود. بنابراين با اندازه گيري قدرت کاهندگي محلول آنزيم – سوبسترا قبل و بعد از انکوباسيون، فعاليت آنزيم را اندازه مي گرفتند. کاهندگي با استفاده از ترکيبات مس سنجيده مي شد و به صورت ميلي گرم گلوکوز آزاد شده بيان مي شد(62). محدوديت آن، مداخله عوامل احيا کننده فرعي درمحيط بود که در سرم بيماران ديابتي کنترل اين مسأله مشکل زا است و از طرفي آماده سازي سوبسترا نيز مشکل بود.
در روش ويسکومتريک که توسط ديويسون معرفي شد(15)، کاهش وزن مولکولي نشاسته که در ويسکوزيته محلول مؤثراست، اساس سنجش بود. اين اندازه گيري در ويسکوزيمتر “استوالد” انجام مي شد. زمان لازم براي کاهش ويسکوزيته تا بيست درصد، بياني از فعاليت آنزيم بود (16).
زمان انکوباسيون حتماً متغير بود زيرا سياليت رابطه اي خطي با زمان ندارد؛ سرم حاوي آنزيم موردنظر، کمي ويسکوز است پس تداخل اجتناب ناپذير بود (29).
2-7-2 – روشهاي رنگ سنجي:
روشي که توسط فووا ابداع شده، خيلي استفاده مي شود و بر اساس رنگ حاصل از اتصال يد با پليمرهاي نشاسته مي باشد. در گزارشهاي مختلف از محققان، اختلاف زيادي در غلظتهاي استفاده شده يد ( از 3 ميکرومول تا 25/0 ميلي مول ) و طول موجهاي مورد استفاده ( از 550 تا 700 نانومتر) ديده مي شود. چون در اين روش حجم نهايي بايد به 20 تا 200 ميلي ليتر برسد، براي تعداد زياد نمونه مناسب نيست. بنابراين زيائو و همکارانش بر پايه همين واکنش نشاسته با کلر، روشي را در ميکروپليت ابداع کردند(76).
برنفلد (با استفاده از آميلوپکتين سيب زميني بعنوان سوبسترا و يک محلول دي نيتروساليسيليک اسيد) روشي را براي اندازه گيري آلفاآميلاز پانکراسي ابداع کرد که در آن فعاليت آنزيم توسط تعداد گروههاي کاهنده ايجاد شده توسط آنزيم در طي هيدروليز سوبسترا تعيين مي شد (5). بعد از آن اصلاحاتي روي اين روش انجام شد مثلاً کانو سوبسترا را به نشاسته محلول تغيير داد(33).
امروزه دو روش اصلي براي تعيين فعاليت اين آنزيمها وجود دارد: يکي بر پايه اندازه گيري مقدار قندهاي احياکننده است که روش “دي نيتروساليسيليک اسيد” و روش “نلسون – سوموگي” از اين جمله اند(50) ، و روش ديگر همان روش “فووا” است (75).
2-8- معماري دمين هاي ساختار آلفا آميلاز (Domain):
آلفا آميلاز شامل تعدادي از دمينهاي پروتئيني مجزا است. دمين عملکردي داراي يک ساختار شامل هشت رشته آلفا / بتا در هر بشکه است که شامل سايت فعال ، دمين متصل شونده به کلسيم مي باشد(1). چندين آلفا آميلاز داراي يک دمين صحفه بتا يا beta-sheet domain هستند، که معمولا در پايانه C است (32و31). اين دومين به عنوان پنج رشته آنتي پارالل ورقه بتا دسته بندي مي شود (42).(شکل2-2)

7
2-9- ژن هاي آلفا آميلاز در انسان:
بزاقي: AMY1A, AMY1B, AMY1C
پانکراسي: AMY2A, AMY2B
آلفا آميلاز پانکراسي توسط ژن هاي AMY-2A و AMY-2B و آلفا آميلاز غدد بزاقي توسط ژن هاي AMY-1A وAMY-1B و AMY-1Cکد مي شود که روي کروموزوم 1p21 واقع شده اند(24و22). (شکل2-3)
آلفا آميلاز بزاقي و پانکراسي درجه بالايي از تشابه توالي اسيدهاي آمينه را دارند. 97? شباهت در کل آنزيم و 92? در دمين کاتاليتيک ديده مي شود (56و54).
تحقيقات نشان داده است که ژن آميلاز غدد بزاقي در انسان تقريبا حدود kb10 است که داراي 11 اگزون و 10 اينترون مي باشد که اندازه اگزون ها بين bp231-100 است (47).
8
1
ژن AMY-2B آلفا آميلاز ي را کد مي کند که توالي آمينو اسيدي آن بسيار مشابه با آميلاز بزاقي(S) و پانکراسي(P) است که در بافت کارسينوئيدي ريه نيز بيان مي شود. ژن AMY-2B به ميزان کم در کبد انسان بيان مي شود. در موش ، توالي رونوشت هاي P – آميلاز به طور عمده متفاوت با آميلاز موجود در غدد بزاقي و کبد است در حالي که رونوشت آميلاز کبد در مقابل رونوشت S – آميلاز فقط در انتهاي توالي 5´ متفاوت است (8 و35). ژن کاذب -actin? در ناحيه بالا دست ژن AMY-2B واقع شده است. در همه ژن ها به جز AMY-2B ژن کاذب -actin? توسط عناصري شبه رتروويروسي دروني جدا شده است.
ژن هاي پانکراسي در مقايسه با AMY-2A شامل باقي مانده LTR9 سمت چپ است. وجود عناصر شبه رترو ويروسي داخلي در ارتباط با بيان آميلاز در غدد بزاقي نشان مي دهد که توالي رتروويروسي ممکن است در تنظيم توالي بزاقي شرکت داشته باشند (48). رونويسي از ژن هاي آميلاز پانکراسي از اگزون a شروع مي شود در حالي که رونويسي از ژن هاي آميلاز غدد بزاقي از اگزون غير ترجمه(NTE10) با ژن کاذب -actin?شروع مي شود(23 و58). (شکل2-4)
2-10- آلفا آميلاز در موش:
آلفا آميلاز در موش ها توسط خانواده اي از ژن ها بر روي کروموزوم 3 (chr 3) بيان مي شود (59).
AMY1 يک ژن تک نسخه اي است که در بيشتر گونه هاي موش بيان مي شود. ناحيه AMY1 از دو پروموتور آلترناتيو در ناحيه بالادست ژن هاي ساختاري (kb5/4-5/7) رونويسي مي شود. يکي از اين پروموتورها در غده پاراتيروئيد و ديگري در کبد و غده پاراتيروئيد فعال است(36).
رونوشت هاي اوليه از اين پروموتورها پيرايش مي شوند و توليد mRNA هايي مي کنند که فقط در ناحيه 5´ غيرترجمه شونده با هم متفاوت است(25).158 نوکلئوتيد ناحيه انتهايي 5´mRNA آلفا آميلاز کبدي با 47 نوکلئوتيد انتهايي غده بزاقي متفاوت است.
تحقيقات نشان مي دهد که mRNA آلفا آميلاز در کبد و غده بزاقي از يک توالي DNA يکسان به طور متفاوتي در بافت هاي مختلف رونويس و پردازش مي شوند. رونوشت هاي ژن AMY2 به طور اختصاصي در غده مترشحه پانکراس بيان مي شود(60).
اما مطالعات نشان مي دهد که بيان AMY2 به پانکراس محدود نمي شود و در سطح کم در سلول هاي کبدي بيان مي شود(39).
2-10-1- تفاوت توالي انتهاي 5´ mRNA هاي آلفا آميلاز کبدي و غدد بزاقي موش از لحاظ اندازه:
هيبريدهاي بين cDNA ژن آلفا آميلاز غدد بزاقي و mRNA کبدي موش، در تمام طول 1600 نوکلئوتيدي cDNA در مقابل آنزيم نوکلئاز S1 مقاومت نشان داده است، بدين معني که ممکن است محل توالي مسئول تفاوت توالي بين mRNA غدد بزاقي و کبدي درنتهاي يک يا دو انتهاي نوع کبدي قرار داشته باشد (36).
اتوراديو گرافي انجام شده که در شکل (2-5) مشاهده مي شود نشان دهنده ي اين است که توالي اي که بعنوان عامل تفاوت در سايز بين mRNA آلفا آميلاز کبدي و غدد بزاقي شناخته مي شود در انتهاي 5´ قرار دارد. در شکل (2-5) استراتژي به کار رفته در جدا سازي قطعات انتهايي 5´ و3´ mRNA آلفا آميلاز کبدي و غدد بزاقي، استفاده از Rnase Hمي باشد(25) .
11
12شکل 2-5- نمايش قرار گيري توالي اي که بعنوان عامل تفاوت در سايز بين mRAN آلفا آميلاز کبدي و غدد بزاقي است.
2-10-2- مطالعات مربوط به آناليز توالي mRNA آلفا آميلاز کبدي:
براي تعيين توالي mRNA آلفا آميلاز کبدي، استراتژي به کار رفته شامل آشکار سازي توالي cDNA آن بوده است(25).


پاسخ دهید