1-9-2 نقشه‏ي ژنوم بيماري‏ها26
1-9-3 تعيين هويت افراد استفاده کننده از سرنگ مشترک26
1-9-4 تشخيص کلون‏هاي موفق26
1-9-5 بررسي و نظارت روي پيوند عضو26
1-9-6 تشخيص کايمرهاي ژنتيکي26
1-9-7 مشخص نمودن خطوط سلولي27
1-9-8 تشخيص تومورهاي سرطاني27
1-10 روش‏هاي کلي شناسايي هويت افراد در سطح مولکولي27
1-10-1 روش انگشت‌نگاري ژنتيکي از طريق هيبريد‌کردن با DNA جستجوگر27
1-10-1-1 محدوديت‏هاي روش انگشت‌نگاري29
1-10-2 روش پروفايلينگ29
1-11 تاريخچه استفاده از مارکرهايSTR30
1-12 CODIS چيست؟31
1-13 کيت مورد استفاده در تعيين هويت32
1-14 معرفي استان‏ها34
1-14-1 استان کرمانشاه34
1-14-1-1 موقعيت جغرافيايي34
1-14-2 استان يَزد35
1-14-2-1 موقعيت جغرافيايي36
1-15 هدف از تحقيق:37
فصل دوم38
2-1 نمونه‌گيري39
2-2 استخراج DNA به روش نمک اشباع39
2-3 آماده‌سازي نمونه‌ها جهت انجام تست DNA Typing40
?-3-1 رسوب‌گذاري با اتانول41
2-3-2 تعيين غلظت نمونه‌هاي DNA توسط دستگاه Nanodrop42
2-3-3 تهيه‌ي Working Stoke42
2-4 تست DNA Typing43
2-4-1 Multiplex PCR43
2-5 مواد و تجهيزات مورد نياز در DNA Typing44
2-5-1 آزمايش DNA Typing44
2-5-2 جداسازي قطعات45
2-5-2-1 تجهيزات لازم45
2-5-2-2 آماده‌سازي دستگاه جهت جداسازي قطعات46
2-5-2-3 روش جداسازي قطعات46
2-6 آناليز داده‌ها47
3-1 نمونه‏ها53
3-2 پروفايل ژنتيکي53
3-2 نتايج حاصل از آناليز نمونه‏ها55
3-3 نتايج حاصل از آناليز نمونه‏هاي کرمانشاه56
3-4 نتايج حاصل از آناليز نمونه‌هاي يزد60
فصل چهارم65
4-1 بحث66
4-2 نتيجه‏گيري73
4-3 پيشنهادات73
منابع انگليسي74
منابع فارسي………………………………………………………………………………………………………….75
فهرست جداول
شکل 1-1 انواع نشان‌گرهاي ژنتيکي ]10[7
جدول 1-1 جايگاه‏هاي موجود در کيت ABI33
جدول2-1 محلولI استخراج DNA (محلول ليز‌کننده گلبول‌هاي قرمز)39

جدول 2-2 محلول II استخراج DNA (محلول ليز‌کننده گلبول‌هاي سفيد)40
جدول 2-3 ترکيبات TE40
جدول 2-4 شرايط PCR45
جدول ?-5 تنظيمات دستگاه ABI3130 در جداسازي قطعات STR46
شکل2-4 چگونگي عملکرد دستگاه الکتروفورز موئينه‌اي[26]47
جدول 2-6 مواد فلورسنت موجود در کيت ABI و رنگهايشان48
شکل2-5 مواد مختلف در طول موج‌هاي متفاوتي نور خود را ساطع مي‌کنند[26]48
جدول 2-7 ماده فلورسنت مورد استفاده براي هر جايگاه[25]49
شکل3-1 پروفايل ژنتيکي يک فرد54
جدول3- 2 فراواني آللي و ساير پارامترهاي جمعيتي و پزشکي‌قانوني در جمعيت يزد را نشان مي‏دهد.60
جدول 4-1 مقايسه جمعيت کرمانشاه با ساير جمعيت‏ها67
جدول 4-2 مقايسه جمعيت يزد با ساير جمعيت‏ها68
فهرست شکل‌ها
شکل 1-2 کراسينگ‌آور و مبادلات نابرابر بين کروماتيدهاي خواهري سبب ايجاد حذف‌شدگي يا الحاق مي‌شود]23.[17
شکل 1-3 متزلزل بودن پلي‌مراز حين همانندسازي DNA مي‏تواند طول تکرار را به اندازه يک يا دو واحد تغيير دهد [23].18
شکل 1-4 آلل‏هاي فرزندان مجموعه‏اي از آلل‏هاي والدين آنها مي‏باشد [62].21
شکل 1-5 شناسائي مجرمين به کمک مارکرهاي STR[26].23
شکل 1-6 مراحل انگشت‌نگاري ژنتيکي [38].28
شکل 1-7 مراحل پروفايلينگ DNA[36].30
شکل 1-8 جايگاه‌هاي CODIS روي کروموزوم‌هاي انسان[25].32
شکل 1-9 موقعيت جغرافيائي استان کرمانشاه [44].35
شکل 1-10 موقعيت جغرافيائي استان يزد[45].36
شکل2-2 استفاده از Multiplex PCR در روش پروفايلينگ[36]44
شکل 2-3 دستگاه الکتروفورز موئينه اي[51]46
شکل 2-6ladder به‌کاررفته در کيت ABI[25]50
شکل 4-1 درخت فيلوژنتيکي ميان سيزده جمعيت مختلف[46]71
شکل 4-2.درخت فيلوژنتيکي ميان نه جمعيت مختلف[46]71
فهرست نمودار‌ها
نمودار3-1 پارامترهاي ژنتيکي جمعيت استان کرمانشاه برحسب درصد60
نمودار3-2 پارامترهاي ژنتيک جمعيت استان يزد برحسب درصد64
چکيده
بررسي تنوع ژنتيکي اقوام ايراني با استفاده از STR
مونا داودبيگي بررسي تنوع ژنتيکي در جمعيت‏ها با استفاده ار تعيين فراواني آللي و پارامترهاي ژنتيکي روش نويني است که در سال‏هاي گذشته در بسياري از جمعيت‏هاي جهان صورت گرفته و با استفاده از آن شباهت بسياري از جمعيت‏ها به يکديگر مشخص گرديده. شباهت جمعيت‏ها نشان‌دهنده‏ي همسان‌بودن خزانه‏ي ژنتيکي آنها و احتمالا يکسان‌بودن آن جمعيت‏ها در گذشته است. پس اين احتمال وجود دارد که اين جمعيت‏ها در گذشته يک جمعيت بوده باشند و بعد‏ها به دلايل جغرافيايي و يا مهاجرت‏ها از يکديگر جدا شده باشند. يکي از راه‏هاي بررسي تنوع‌ ژنتيکي در جمعيت‏ها استفاده از توالي‏هاي کوتاه تکراري مي‏باشد .هدف اين مطالعه بررسي تنوع ژنتيکي در دو قوم يزد و کرد (کرمانشاه) از ايران بود. بدين منظور پروفايل ژنتيکي پنجاه فرد غير‌خويشاوند از هر يک از جمعيت‏هاي کرمانشاه و يزد با استفاده از کيت ABIتهيه شد. اين کيت حاوي پانزده جايگاه D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOX و TH01 و ژن آميلوژنين (براي تعيين جنسيت افراد) مي‏باشد. نتايج نشان‌دادند که به جز دو جايگاه D7S820 وD19S433 در جمعيت کرمانشاه و سه جايگاه D21S11 ,D19S433 و VWA در يزد ساير جايگاه‏ها در تعادل هاردي‏واينبرگ بودند. همچنين پارامترهاي پزشکي‌قانوني شامل PIC,PD,PE,MP در اين مطالعه بررسي شدند. سپس دو جمعيت با جمعيت‏هاي کشورهاي همسايه مقايسه شدند. اين مطالعه نشان داد که اين جايگاه‏ها، جايگاه‏هاي مناسب براي استفاده در تست‏هاي تعيين هويت و مطالعات جمعيتي مي‏باشند. در نتيجه‏‏ي مقايسات هم ديده شد که هر دو جمعيت يزد و کرمانشاه شباهت زيادي به جمعيت کشور ترکيه داشتند ولي با ساير کشورها متفاوت بودند. از طرفي يزد نسبت به کرمانشاه داراي جمعيت همگن‌تري بود که اين مسئله مي‏تواند به‌علت بکر بودن اين جمعيت در طول ساليان مختلف باشد.
کلمات کليدي: تواليهاي کوتاه تکراري، نشانگرهاي مولکولي، ژنتيک جمعيت
Abstract
Genetic variation in two Iranian population with STR
Mona Davood Beigi
In recent years studying genetic variation among population by determination of allele frequencies and genetic parameters became a new method that it has been done in different population all around the world. By using this method lots of similarities has been founded among population around the world. These similarities represent the same genetic pool and also it may show the same population in the past as well. So it seems that different population were one at the first and geographical situations or migrations were the reasons that caused its separation.
Studying short tandem repeats (STR) in genome is the best way to founding genetic variation in population. The aim of this study was to investigate the genetic variation of two population of Iran, Yazd and Kermanshah people.
For this purpose the genetic profile of 50 unrelated individual from each population prepared by using ABI kit. This kit contains fifteen str loci (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, VWA, TPOX, D18S51, D5S818 and FGA) and also amylogenin gene for sex determination. The result showed all the loci were in Hardy Weinberg equilibrium except two loci(D19s433 , D2s820) in Kermanshah and three loci (D19s433, D21s11 and VWA) in Yazd population. More over forensic parameters including PIC, PD, PE and MP have been calculated. After all the results have been compared with other population in neighbor countries.
This study revealed that these loci were the suitable loci for identification people and studying genetic population variation. Also the comparison showed that both of Yazd and Kermanshah people were similar to Turkish genetically, but were different from other countries. In addition Yazd has more homogeneous population than Kermanshah, that it could be due to pristine gene pool of this population in the past centuries.
Keywords: Short tandem repeats; Microsatellite markers; Population genetic
فصل اول
مقدمه
1-1 مقدمه
درگذشته مطالعه‏ي تکامل و مهاجرت‏ها از طريق کشف و بررسي بقاياي اسکلتي و فسيل‏ها انجام مي‏شد. اما از حدود سه دهه‏ي پيش، باستان‏شناسان و زيست‏شناسان با به‌کار‏گيري آناليز‏هاي DNA موفق به کشف‏هاي بسيار دقيقي شدند که کمک فراواني به رديابي تاريخ مهاجرت بشر و تکامل انسان‏ها نموده است. يکي از پر‏کاربرد‏ترين راه‏هاي آناليز DNA، بررسي نشان‌گرهاي1 ژنتيکي افراد است، که از مهم‌ترين آنها مي‏توان به توالي‏هاي کوتاه تکراري2 موسوم به STR اشاره کرد. STR‏ها، توالي‏هايي به طول يک تا سيزده نوکلئوتيد هستند که در ژنوم موجودات در نواحي غير‌کد‏کننده موجود مي‏باشند. هر فرد توالي‏هاي منحصر به فردي دارد و هيچ دو نفري در جهان نيستند که توالي‏هاي يکساني داشته باشند. به همين دليل ازSTR ‏ها مي‏توان در مطالعات جمعيتي و بررسي تنوع ژنتيکي در جمعيت‏ها سود جست [1].
علاوه بر مطالعات جمعيتي ازSTR ‏ها مي‏توان در موارد تعيين هويت‏، تعيين ابويت، تست‏هاي پزشکي‏قانوني و ساير موارد استفاده کرد. به طور معمول STRهايي که براي تعيين هويت و مطالعات ژنتيکي جمعيت به‌کار مي‏روند، يکسان هستند و شامل پانزده جايگاه به نام‏هاي D8S1179،D21S11 ، D7S820،CSF ،D3S1358 ،TH01 ، D13S317، D16S539،D2S1338 ، D19S433، VWA، TPOX،D18S51 ، D5S818،FGA ،VWA ، TPOXو TH01 مي‏باشند [1].
هم‌چنين از روش مشترکي موسوم به تعيين الگوي DNA در اين زمينه‏ها استفاده مي‏شود. هر فرد داراي الگوي DNA منحصر به فرد است که تا پايان عمر تغيير نخواهد کرد. محققان دريافتند که افراد يک جمعيت در الگوهاي ژنتيکي خود داراي تشابهاتي هستند که منحصر به همان جمعيت است و با الگوي افراد جمعيت‏هاي ديگر متفاوت است. از اين تفاوت‏ها مي‏توان براي رديابي تاريخ مهاجرت و تکامل انسان‏ها استفاده نمود (1).
1-2 نشان‌گر چيست؟
صفاتي را که مي‏توانند به عنوان نشانه‏اي براي شناسايي افراد حامل آن صفت مورد استفاده قرار گيرند، نشان‌گر مي‏نامند. مندل3 نخستين کسي بود که از نشان‌گرهاي ظاهري براي مطالعه چگونگي توارث صفات در نخود‌فرنگي استفاده کرد. اما گاهي صفات به سادگي و با چشم غير مسلح قابل مشاهده نيستند، مانند گروه خوني. براي مشاهده چنين صفاتي بايد آزمايش‏هاي خاصي صورت گيرد. به طور کلي هر صفتي که بين افراد متفاوت باشد، ناشي از تفاوت موجود ميان محتواي ژنوم آنها مي‏باشد. حتي بروز صفات به صورت متفاوت در ميان افراد (در شرايط محيطي يکسان)، به علت تفاوت‏ در ژنوم آنها است. اين تفاوت‏ها مي‏توانند به عنوان نشانه يا نشان‌گر ژنتيک به کار گرفته شوند. به طور کلي براي آنکه صفتي به عنوان نشان‌گر ژنتيک مورد استفاده قرار گيرد، بايد دست کم دو ويژگي داشته باشد‌:
1-در بين دو فرد متفاوت باشد (چند شکلي4)
2-به توارث برسد (2).
1-3 انواع نشان‌گرهاي ژنتيکي
نشان‌گرهاي ژنتيکي عبارتند از:
1-نشان‌گرهاي مورفولوژيک
2-نشان‌گرهاي پروتئيني
3-نشان‌گرهاي مولکولي در سطح DNA و RNA
1-3-1 نشان‌گرهاي مورفولوژيک
کاربرد نشان‌گرهاي مورفولوژيک به ده‏ها سال پيش از کشف DNA مربوط مي‏شود. نشان‌گرهاي مورفولوژيکي که پيامد جهش‏هاي قابل رويت در مورفولوژي هسته، از ابتداي اين سده مورد استفاده قرار گرفتند. صفات مورفولوژيکي که عمدتا توسط يک ژن کنترل مي‏شوند، مي‏توانند به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار گيرند. اين نشان‌گرها شامل دامنه وسيعي از ژن‏هاي کنترل‌کننده صفات فنوتيپي هستند و جز نخستين نشان‌گرها به شمار مي‌آيند و از زمان‏هاي بسيار دور يعني از زماني که محل ژن‏ها روي کروموزوم مشخص شد، مورد استفاده قرار مي‏گرفتند (2).
معايب نشان‌گرهاي مورفولوژيک
> اغلب داراي توارث غالب و مغلوب بوده و اثرات اپيستازي و پليوتروپي5 دارند.
> تحت تاثير شرايط محيطي و مرحله رشد موجود قرار مي‏گيرند.
> فراواني و تنوع کمي دارند.
> گاهي براي مشاهده و ثبت آنها بايد منتظر ظهور آنها ماند.
> اساس ژنتيک بسياري از نشان‌گرهاي مورفولوژيک هنوز مشخص نشده است‌(2).

1-3-2 نشان‌گرهاي پروتئيني
در دهه‌ي 1950، نشان‌گرهاي پروتئيني قابل مشاهده توسط الکتروفورز پروتئين‏ها تحول شگرفي را ايجاد نمودند. برخي از تفاوت‏هاي موجود در رديفDNA بين دو موجود ممکن است به صورت پروتئين‏هايي با اندازه‏هاي مختلف تجلي کنند، که به روش‏هاي مختلف بيوشيميايي قابل ثبت و مطالعه مي‏گردند. اين قبيل نشان‌گرها را نشان‌گرهاي مولکولي در سطح پروتئين مي‏نامند که از آن جمله مي‏توان به سيستم آيزوزايم6/آلوزايم7 اشاره کرد. معمول‏ترين نوع نشان‌گرهاي پروتئيني آيزوزايم‏ها هستند که فرم‏هاي مختلف يک آنزيم را نشان مي‏دهند. آيزوزايم‏ها به‏ طور گسترده در بررسي تنوع ژنتيکي به‌کار گرفته‌شدند. نشان‌گرهاي پروتئيني تغييرات را در سطح رديف و عمل ژن به صورت نشان‌گرهاي هم‌بارز نشان مي‏دهند. اما اين دسته از نشان‌گرها هم داراي معايبي هستند. برخي از معايب آن‏ها عبارت‌اند از:
> محدود بودن فراواني اين نوع نشان‌گرها؛
> تعداد آيزوزايم‏هاي قابل ثبت و مشاهده که مي‏توان از آنها به عنوان نشان‌گر استفاده کرد به يکصد عدد نمي‏رسد؛
> محدود بودن تنوع ژنتيکي قابل ثبت در آيزوزايم‏ها‌(نداشتن چند شکلي)؛
> پيچيدگي فنوتيپ‏هاي الکتروفورزي آيزوزايم‏ها به دليل دخيل بودن آنزيم‏هاي مرکب از چند پلي‌پپتيد مستقل در ترکيب برخي از آيزوزايم‏ها‌(3).
اما پيشرفت‏هايي که در زمينه‏ي الکتروفورز دو‏بعدي با قدرت تفکيک زياد پديد آمده، تجزيه تحليل هم‌زمان هزاران پروتئين را ميسر ساخته و مجددا به‌عنوان فناوري پيشتاز در عرصه نشان‌گر‏هاي مولکولي مطرح شده‏اند. تاثيرپذيري نشان‌گرها از محيط که به‌طور معمول به‌عنوان يکي از محدوديت‏ها و نکات منفي نشان‌گرهاي مولکولي ياد مي‏شود، در مورد اين نشان‌گر‏ها تبديل به برتري شده و جايگاه متمايزي را در بين ساير نشان‌گرها به ارمغان آورده است. پروتئوميکس‌(مطالعه سراسري کل پروتئين‏هاي موجود در يک سلول يا يک ارگانيسم) مي‏تواند به‌طور هم‌زمان براي مطالعه بيان ژن و هم‌چنين براي شناسايي پروتئين‏هاي واکنش دهنده به شرايط محيطي مورد استفاده قرار گيرد(3).
1-3-3 نشان‌گرهاي مولکوليDNA وRNA
دسته‌اي ديگر از تفاوت‏هاي موجود در سطح DNA هيچ تظاهري ندارند. نه صفت خاصي را کنترل مي‏کنند و نه در رديف اسيد‏هاي آمينه پروتئين‏ها تاثيري برجاي مي‌گذارند. اين دسته از تفاوت‏ها را مي‏توان با روش‏هاي مختلف شناسايي، قابل ديدن و رديابي کرد و به عنوان نشان‌گر مورد استفاده قرار داد. اين نشان‌گر‏ها که تعدادشان تقريبا نا‏محدود است، فقط از راه تجزيه و تحليل مستقيم DNA قابل ثبت هستند. بنابراين به آنها نشان‌گرهاي مولکولي در سطح DNA گفته مي‏شود. نشان‌گرهاي مولکولي فراوان و در هر موجود زنده‌اي مي‌توانند مورد استفاده قرار گيرند. تاکنون تعداد زيادي از نشان‌گرهاي DNA معرفي شده‌اند. اين نشان‌گرها از نظر بسياري از ويژگي‏ها مانند درجه‏ي چندشکلي، غالب يا هم‌بارز بودن، تعداد جايگاه‏هاي تجزيه شده در هر آزمايش DNA، توزيع در سطح کروموزوم، تکرار‌پذيري، نياز يا عدم نياز به توالي‏يابي DNA الگو و هزينه‏ي مورد نياز با همديگر متفاوت‌اند. انتخاب بهترين نشان‌گر به هدف مطالعه (انگشت نگاري، تهيه نقشه پيوستگي8، ژنتيک جمعيت و روابط تکاملي) و سطح پلوئيدي موجود مورد مطالعه بستگي دارد‌(4).
مزاياي کاربرد نشان‌گرهاي مولکولي
* عدم تاثيرپذيري آنها از شرايط محيطي خارجي و داخلي موجود؛
* امکان به‌کارگيري آنها در مراحل نخستين رشد جنيني حيوانات و مراحل نخستين رشد موجودات؛
* فراهم نمودن امکان مطالعه موجودات در خارج از فصل و محيط کشت؛
* دقت و قابليت مطلوب تفسير نتايج؛
* هم‌بارز بودن بسياري از اين نشان‌گرها؛
* امکان استفاده از آنها در مورد گونه‏هاي منقرض شده؛
* سهولت تشخيص افراد ناخالص از خالص؛
* سهولت امتيازدهي و تجزيه و تحليل نتايج؛
* دسترسي به برنامه‏هاي رايانه‏اي قوي براي تجزيه و تحليل و تفسير سريع نتايج‌(4)
انواع نشان‌گرهاي مولکولي
نشان‌گرهاي DNA گروه بزرگي از نشان‌گرها را تشکيل مي‏دهند. اين نشان‌گرها سير تحول و تکامل خود را به پايان نرسانده‏اند و ابداع و معرفي روش‏هاي متنوع و جديدتر ثبت و مشاهده‏ي تفاوت‏هاي ژنتيک بين موجودات از طريق مطالعه‏ي مستقيم تفاوت‏هاي موجود در بين رديف‏هاي DNA هم‌چنان ادامه دارد. نشان‌گر‏هاي DNA در مدت يک دهه تکاملي شگرف و تحسين‌برانگيز داشته‏اند‌(5).
ابداع و معرفي واکنش زنجيره‌اي پلي‌مراز 9 يا PCR يک روش سريع تکثير آزمايشگاهي قطعه يا قطعه‌هاي مورد نظر DNA است. در واقع PCR روشي بسيار قوي است که تکثير رديف منتخبي از مولکول يک ژنوم را تا چندين ميليون در کم‌تر از نيم‌روز امکان‌پذير مي‏سازد. اما اين فرايند هنگامي امکان‌پذير است که دست‌کم رديف کوتاهي از دو انتهاي قطعه DNA مورد نظر معلوم باشد. در اين فرايند که تقليدي از فرايند همانندسازي DNAدر طبيعت است، اليگونوکلئوتيدهاي10 مصنوعي که مکمل رديف شناخته شده دو انتهاي قطعه‏ي مورد‌نظرDNA هستند، به‌عنوان آغازگر11 مورد استفاده قرار مي‏گيرند تا واکنش آنزيمي همانندسازي DNA درون لوله‌ي آزمايش امکان‌پذير شود. اين همانند‏سازي فرايندي آنزيمي است و توسط انواع مختلفي از آنزيم‏هاي پلي‌مراز صورت مي‏گيرد. امروزه تعداد زيادي از اين نوع آنزيم‏ها به صورت تجاري دردسترس هستند‌(6).
واکنش زنجيره‏اي پلي‌مراز (PCR) در سال 1983 توسط کري‌موليس12 در حاليکه در يک نيمه شب تابستاني در حال رانندگي بود، ابداع گرديد و سبب انقلاب عظيمي در زيست شناسي مولکولي شد(6).
همان‌گونه که در شکل 1-1 نشان داده شده است، نشان‌گرهاي DNAبه دو دسته‏ي کلي طبقه‌بندي مي‏شوند.
1. نشان‌گرهاي DNAمبتني بر PCR
2. نشان‌گرهاي DNA غير مبتني PCR(6).

شکل 1-1 انواع نشان‌گرهاي ژنتيکي‌(10)
1-3-3-1 نشان‌گرهاي غير مبتني بر PCR
اين دسته از نشان‌گرهاي DNA بدون استفاده از روشPCR توليد مي‌شوند و مورد استفاده قرار مي‌گيرند.
انواع نشان‌گرهاي غير مبتني بر PCR به شرح زير است:
* تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزيم‏هاي محدودگر13(RFLP)
* پويش ژنومي نشانه‏هاي هضم14 (RLGS)
* ماهوارک‏ها15
1-3-3-1-1 تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزيم‌هاي محدودگر( (RFLP
سرگروه نشان‌گرهاي غير‌مبتني برPCR ، همان تفاوت طول قطعه‏هاي حاصل از هضم DNA توسط آنزيم‏هاي محدودگر يا RFLP است. از بين نشان‌گرهاي مولکولي DNA، RFLP ها اولين نشان‌گرهايي بودند که براي نقشه‌يابي ژنوم انسان توسط بوتستين16 و همکاران در سال 1980 و پس از آن براي نقشه‌يابي ژنوم گياهان توسط بر17 و همکاران در سال 1983 مورد استفاده قرار گرفتند. در اوايل دهه 1980 بوتستين و همکاران استفاده از تفاوت طول قطعه‏هاي حاصل از هضم يا RFLP را براي مطالعه‏ي مستقيم DNA و يافتن نشان‌گر‏هاي ژنتيک جديد معرفي کردند. اين تحول از پيامد‏هاي منطقي کشف آنزيم‏هاي محدودگر بود. اين آنزيم‏ها که بسيار اختصاصي‏ هستند، رديف‏هاي ويژه‏اي را روي مولکولDNA شناسايي کرده و آنها را از محل خاصي (نقطه‏ي برش) برش مي‏دهند‌(7).
RFLP الزاما مختص ژن‏هاي خاص نيست، بلکه در کل ژنوم پراکنده است. ازاين رو، از نشان‌گرهاي RFLP براي نقشه‌يابي تمام ژن‌ها در ژنوم انسان استفاده مي‏شد(5). علاوه برRFLP که هنوز هم از قدرتمندترين و معتبرترين نشان‌گرهايDNA است، انواع مختلف نشان‌گرهايDNA با تفاوت‌هاي زيادي از نظر تکنيکي و روش توليد، نحوه‌ي کاربرد، امتياز‌بندي، تجزيه و تحليل و تفسير نتايج به سرعت ابداع ومعرفي شده‌اند‌(7).
مهم‌ترين مزاياي RFLP
* تکرارپذريري، دقت و قابليت اعتماد اين نشان‌گر فوق‌العاده زياد است؛
* اين نشان‌گر هم‌بارز است و امکان تشخيص افراد خالص را از افراد ناخالص فراهم مي‏آورد؛
* فراواني اين نشان‌گر در حد بالايي است؛
* RFLP تحت تاثير عوامل محيطي داخلي و خارجي نبوده و صد در صد ژنتيکي است(8).
برخي معايب RFLP
> دشواري، پيچيدگي و وقت‌گير بودن؛
> RFLP ژنوم‌هاي بزرگ نيازمند کاربرد مواد پرتوزا يا روش‌هاي پيچيده‏تر و گران‏تر بيوشيميايي است؛
> RFLP نيازمند نگه‌داري ميکروارگانيسم‌ها18 به‌منظور تهيه‏ي کاوشگر است که خود بر پيچيدگي اين روش مي‏افزايد؛
> هزينه‏ي اوليه و نگه‏داري کاوشگر‏ها و کاربرد آنها بسيار زياد است؛
> نيازمندي به مقدار نسبتا زياد DNA از محدوديت‏هاي ديگر روش RFLPاست به‌طوري که ده‏ها ميکروگرم از DNAبراي هر فرد به منظور تجزيه‏ي ژنوم مورد نياز است؛
> از ديگر محدوديت‏هاي اين نشان‌گر آن است که در گونه‏هاي بسيار نزديک به يکديگر اين نوع نشان‌گر‏ها آلل‏هاي مشابهي را نشان مي‏دهند(8).
1-3-3-1-2 پويش ژنومي نشانه‏هاي هضم (RLGS)

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

در سال1991، هاتادا19 و همکاران روشي را براي شناسايي و انگشت‌نگاري موجودات عالي ابداع و معرفي کردند. پيش از ابداع اين روش که بر مبناي نشان‌دار کردن هم‌زمان انتهاي هضم شده‏ي هزاران قطعه‌ي DNA است، رديابي و ثبت موجودات عالي با روش نشان‌دار کردن انتهاي هضم شده غير ممکن مي‌نمود. دو دليل اصلي براي اين تصور ذکر شده است:
1. ژنوم موجودات عالي بسيار بزرگ و پيچيده است براي مثال ژنوم انسان 109×3 جفت باز دارد و در نتيجه‏ي هضم آن با آنزيمي مانند EcoRI بيش از يک ميليون قطعه‌ي DNA به وجود مي‌آيد. تفکيک اين تعداد مولکولDNA حتي با الکتروفورز دو بعدي نيز غير ممکن است.
2. معمولا DNA ژنومي در هنگام استخراج به صورت تصادفي و غير‌اختصاصي شکسته مي‌شود و ايجاد مولکول‏هايي با انتهاي تصادفي مي‏کند. اين امر سبب ايجاد پس‌زمينه‌ي ناشي از نشان‌دار شدن اين انتهاها طي فرايند نشان‌دارکردن مي‏شود‌(9).
براي رفع اين دو نقص تدابيري پيش‏بيني شد و روش RLGS ابداع گرديد. اين روش جديد که براي تجزيه و تحليلDNA ژنومي به‌کار مي‌رود، بر مبناي اين فرضيه است که نقاط برش اختصاصي آنزيم‏هاي محدودگر مي‌توانند به‌عنوان نشانه و وجهه تمايز ارقام و افراد به کار گرفته‌شوند.
در اين روش انتهاي آزاد مولکول‌هاي DNA که در اثر صدمات مکانيکي در طي استخراج به وجود آمده‏اند، مسدود مي‏شود. سپس براي کاهش پيچيدگي، DNA ژنومي توسط آنزيم‏هاي محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش به‌طور مستقيم با فسفر پرتوزا نشان‌دار مي‏شوند. آنزيم‏هاي با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود مي‏آورند. سپس با الکتروفورز دو‌بعدي، قطعه‏هاي هضم‌شده‏يDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاري صورت مي‏گيرد. اين روش يک الگوي دو بعدي با هزاران نقطه‏ي پراکنده (قطعه‏هاي نشان‌دارDNA) ايجاد مي‏کند که هر يک مي‏توانند به عنوان يک نشان‌گر به کار گرفته شوند(10)
برخي از مزاياي روشRLGS
* در هر آزمايش هزاران نشان‌گر به‌دست مي‌آيد؛
* مقدار کمي DNAمورد نياز است؛
* در صورت استفاده از آنزيم‌هاي محدودگر متفاوت، تفاوت‏هاي بيشتري ظاهر و ثبت خواهند شد[10].
برخي از معايب روش RLGS
> DNA مورد نياز براي اين روش بايد از کيفيت مطلوبي برخوردار باشد؛
> هضم ناقص DNA توسط آنزيم‏هاي محدودگر نتايج تکرار ناپذير و گمراه کننده‏اي خواهد داشت؛
> اين روش پيچيدگي فوق العاده‏اي داشته و تفسير نتايج حاصل از آن دشوار است(10).
1-3-3-1-3 ماهوارک‏ها
ماهوارک‏ها نخستين بار در سال 1985 توسط جفري20 و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال 1988 تکثير جايگاه‏هاي ژني خاص نواحي تکرارشونده، روي ماهوارک‏ها در ژنوم انسان انجام شد.
اين دسته از نشان‌گرها از نظر تکنيکي مبتني بر استفاده از کاوشگرهاي مصنوعي و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن21 هستند.
ماهوارک‌ها واحدهايي 10 تا 100 جفت بازي هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا يک هسته مشترک 10 تا 15 جفت بازي دارند که احتمالا در تنوع‌پذيري ماهوارک‌ها موثرند. ماهوارک‌ها بيش‌تر در نواحي يوکروماتين ژنوم پستانداران، قارچ‌ها و گياهان متمرکز‌ند. تنوع‌پذيري ماهوارک‌ها در حدي است که گاهي در انگشت‌نگاريDNA انسان مورد استفاده قرار مي‏گيرند. از جمله‌ي ماهوارک‌ها مي‏توان به تکرارهاي پشت سر هم با فراواني بالا22 (VNTR) اشاره کرد[11]. VNTR ها به دو دسته‌ي کلي تقسيم مي‌شوند: VNTR تک مکاني23 و VNTR چند مکاني24.
دسته‏ي نخست، تعداد متفاوت رديف‌هاي تکراري در يک جايگاه ژني و دسته‏ي دوم تعداد متفاوت رديف‌هاي تکرار‌شونده در چندين جايگاه ژني را نشان مي‌دهند. الگوي بانددهي به‌دست آمده با استفاده از کاوشگر‌هاي VNTR تک مکاني ساده‏تر و قابل فهم‌تر است، زيرا هر فرد تعداد کمي باند واضح را نشان مي‏دهد. در حالي‌که تعداد باندهاي به دست آمده از کاوشگرهاي مخصوص VNTRچند‌مکاني بيش‌تر است، به‌طوري که به‌طور هم‌زمان تا بيش از 30 باند به دست مي‏آيد(12).
در نخستين نشان‌گرهاي مبتني بر ماهوارک‌ها، از اليگونوکلئوتيد‏هاي حاوي ريزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گرديد و توسط علي25 و همکاران انگشت‌نگاري اليگونوکلئوتيدي26 نام‌گذاري شد.
از کاوشگرهاي اليگونوکلئوتيدي نشان‏دار‌شده مکمل با موتيف‌هاي کوتاه تکرار‌شونده در هيبريداسيون27 در ژل، با به کارگيري DNAژنومي برش داده شده با آنزيم‌هاي برشي خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشني28 در سال2000 طي تحقيقات خود مراحل زير را براي انگشت‌نگاري اليگونوکلئوتيدي مطرح کردند:
1. جداسازيDNA ژنومي با وزن مولکولي زياد
2. هضم DNAژنومي با يک آنزيم محدودگر مناسب
3. تفکيک قطعه‌هاي حاصل از هضم روي ژل آگارز
4. انتقال ساترن قطعه ها به غشا
5. دو ‏رگ‏گيري غشا با کاوشگر‏هاي(نشاندار با مواد پرتوزا يا غير پرتوزا) اليگونوکلئوتيدي دربردارنده‏ي رديف‌هاي دو يا سه تايي تکراري
6. خودپرتونگاري يا رنگ آميزي براي مشاهده‏ي قطعه‌هاي دو رگ‌شده.
به‌کمک اين روش مي‌توان تنوع نواحي تکرار‌شونده‏ي مورد نظر را آشکار کرد. قطعه‌هايي از DNA که با اليگونوکلئوتيدها دو ‌رگ مي‌شوند، در دامنه‌اي از اندازه‏ي چند صد جفت تا ده کيلو جفت باز قرار مي‏گيرند. هم‌چنين گاهي بيش از يک نوع ماهواره در داخل يک قطعه‏ي برش داده شده قرار مي‌گيرد. تفاوت‏هايي که اين نوع نشان‌گرها نشان مي‏دهند، به دليل تفاوت در طول قطعه‌هاي برش داده‌شده‌اي است که در بردارنده‏ي ماهوارک‌ها هستند. از اين روش براي شناسايي ژنوتيپ‌ها و همچنين در ژنتيک جمعيت استفاده مي‌شود(12).
پس از مدتي، ليت و لوتي29 و سه گروه ديگر همين روش را براي ريزماهواره‏ها(عمدتا از نوع (CA)n) به‌کار بردند و دريافتند که ريز ماهواره‏ها به دو دليل به مراتب آسانتر از ماهوارک‌ها با روش PCR تکثير مي‏شوند:
1-ريزماهواره‏ها کوچکتر از ماهوارک‏ها هستند؛
2-رديف‌هاي تکرار‌شونده ريز ماهواره‏اي فراوانتر و توزيع آنها در کل ژنوم يکنواخت‌تر ازماهوارک‏هاست(13).
1-3-3-2 نشان‌گرهاي مبتني بر PCR
نشان‌گرهاي مبتني بر PCR نشان‌گرهايي هستند که از توالي اليگونوکلئوتيدي به عنوان آغازگر براي تکثير قطعه‏ي خاصي از DNA استفاده مي‌کنند. روش‏هاي مختلف در اين گروه، در طول و توالي آغازگرها، سختي شرايط PCR و روش‏هاي جداسازي و آشکار کردن قطعات با همديگر فرق دارند.
انواع نشان‌گرهاي مبتني بر PCR به شرح زير است:
* تفاوت طول قطعه‌هاي حاصل از تکثير30(AFLP)
* DNA چند شکل تکثير‌شده‏ي تصادفي31(RAPD)
* تفاوت تک نوکلئوتيدي32(SNP)
* نشان‌گرهاي مبتني برنقاط نشانمند از رديف33 (STS)
1-3-3-2-1 تفاوت طول قطعه‌هاي حاصل از تکثير (AFLP)
در سال 1995 نشان‌گرهاي جديدي ابداع و معرفي شدند که به نظر مي‌رسد بسياري از محدوديت‌هاي نشان‌گر‌هاي پيشين را نداشته باشند. در اين روش که AFLP ناميده مي‏شود نشان‌گرهايي توليد مي‏شوند که علاوه بر دارا بودن مزايايRFLP مانند دقت و تکرار‌پذيري ويژگي‌هاي مثبت روش‌هاي مبتني بر واکنش زنجيره‌اي پلي‌مراز را نيز دارند. پايه‌ي اين روش تکثير انتخابي برخي قطعه‌ها از بين تمام قطعه‌هاي هضم شده‌ي DNA است و سه مرحله‌ي مجزا دارد:
1. هضمDNA با يه جفت آنزيم محدودگر و اتصال آنها به آداپتور‌هاي34 اوليگونوکلئوتيدي؛
2. طراحي، ساخت آغازگر و تکثير انتخابي دسته‌اي از قطعه‌هاي حاصل از هضم .با استفاده از رديف بازي آداپتور‌ها و نيز رديف بازي نقاط برش، طراحي و ساخت آغازگر انجام مي‌شود، اما براي تکثير انتخابي قطعه‌هاي حاصل از هضم دو، سه يا چند نوکلئوتيد به انتهاي’3 رديف آغازگر اضافه مي‌شود که موجب مي‌گردد فقط قطعه‌هايي تکثير‌شوند که رديف بلافصل آنها در مجاورت نقطه‌ي برش ،مکمل نوکلئوتيدهاي ياد شده باشد؛
3. جداسازي قطعه‌هاي حاصل از تکثير روي ژل‌هاي توالي‌يابي(پلي‌اکريل‌آميد) و خودپرتونگاري يا رنگ‌آميزي نقره براي ثبت نتيجه‌ها.
با استفاده از اين روش تعداد زيادي از قطعه‌هاي حاصل از هضم، تکثير و قابل رويت مي‌شوند. اين در حالي است که نيازي به دانش اوليه در مورد توالي‌بازي قطعه‌هايي که تکثير مي‌شوند، وجود ندارند. هر يک از اين قطعه‌هايي که به صورت باند روي ژل ظاهر مي‌شوند، مي‌توانند به عنوان يک نشان‌گر ژنتيک مورد استفاده قرار گيرند.
تعداد قطعه‌هايي که با اين روش تکثير مي‌شوند، به دقت و توانمندي روش‌هاي جداسازي (الکتروفورز)، ثبت نتايج و تعداد نوکلئوتيد اضافه شده به انتهاي آغازگر بستگي دارد. معمولا در اين روش بين پنجاه تا صد قطعه‌ي حاصل از هضم تکثير و با استفاده از ژل‌هاي پلي‌اکريل‌اميد واسرشت ساز ثبت مي‏شوند(19)
مزاياي AFLP
* اين روش در مقايسه يا ساير روش‌ها بيشترين تعدا نشان‌گر‌ها به ازاي هر ژل را ايجاد مي‌کند؛
* در اين روش نيازي به تهيه و تدارک و نگه‌داري کاوشگر نيست .دقت و تکرار‌پذيري اين نشان‌گر به دليل انتخاب دماي زياد هم رشته‌سازي و اتصال آغازگر به DNA الگو بيشتر از RAPD است(20).
معايب AFLP
> پيچيدگي نسبي اين روش در مقايسه با ساير روش‌هاي ميتني برPCR ؛
> عدم اطلاع از جايگاه ژني نشان‌گر‌ها؛
> غالب بودن اين نشان‌گر موجب عدم امکان تشخيص افراد خالص از ناخالص مي‏گردد؛
> تکثير قطعه‌هاي غير‌واقعي35 در AFLP موجب کاهش قابليت اعتماد اين روش مي‏گردد(20).

1-3-3-2-2 DNA چندشکل تکثيرشده‏ي تصادفي(RAPD)
در اين روش از تک آغازگرهايي به طول هشت تا ده نوکلئوتيد که رديف بازي آن به طور قراردادي تعيين مي‌گردد، استفاده مي‏شود. در اين واکنش يک آغازگر منفرد نقاط مکمل خود را روي دو رشته‏ي DNA ژنومي مي‌يابد و در آن نقاط به رشته‌هاي DNAمتصل مي‌شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها در روي دو رشته‏ي مقابل به هم نزديک باشند(فاصله‏اي که DNA قابل تکثير باشد)، رديف بين آن دو نقطه طي واکنش PCR تکثير خواهد شد. فراورده‌هاي واکنش PCRروي ژل آگارز از هم جدا مي‏شوند. توليد هر باند بيانگر وجود شباهت زياد بين رديف بازي آغازگرها و رديف بازي محل اتصال درDNA ژنوم است. به طور معمول هر آغازگر تکثير چندين جايگاه مختلف را درDNA ژنومي هدايت خواهد کرد. وجود يا عدم وجود يک باند واحد در ژل هاي RAPD بيانگر جهش نقطه‌اي در محل اتصال آغازگرها و يا حذف يا (اضافه) شدن در ناحيه قابل تکثير است. بنابراين چند شکلي در RAPDمعمولا به شکل حضور و غياب يک باند پديدار مي‏شود. بدين معني که نشان‌گرهاي RAPD از نوع غالب‌اند و افرادي که دو نسخه از يک آلل دارند، به طور کمي از افرادي که يک نسخه از آن آلل را دارند، قابل تشخيص نيستند. تفاوت طول قطعه‏ها در RAPD از طريق تکثير قطعه‌هاي DNA مکمل با رديف‌هاي آغازگرهاي اختياري (رديف مشخص ولي تصادفي) به‌دست مي‌آيند. قطعه‏هاي تکثير شده به صورت نوارهايي با وزن مولکولي متفاوت به‌طور مستقيم روي ژل قابل مشاهده‌اند (15).
مزاياي RAPD
* عدم نياز به کاوشگر، مواد پرتوزا و غيره؛
* امکان بررسي هم زمان چندين جايگاه در ژنوم؛
* عدم نياز به اطلاعات اوليه در مورد ريف DNA براي ساخت آغازگر(16).
معايب RAPD
> عدم تکرار پذيري؛
> حساسيت بسيار به آلودگي؛
> در صورت تغيير شرايط محيطي ظهور باندهاي جديد؛
> نامعلوم بودن جايگاه نشان‌گر RAPD روي نقشه‌ي ژنتيکي(16).
1-3-3-2-3 تفاوت تک نوکلئوتيدي(SNP)
تنوع‌ها و تفاوت‌هايي که به واسطه‏ي اختلاف در يک جايگاه نوکلئوتيدي(به علت جايگزيني، حذف يا ازدياد) اتفاق مي‌افتند، با عنوان تفاوت تک نوکلئوتيدي ناميده مي‏شوند. اين نوع از تنوع به‌وفور در ژنوم انسان اتفاق مي‏افتد به طوري که مطالعات انجام گرفته توسط کاتانو-آنولز36 و گرس هوف37 (1998) در ژنوم انسان و اسب نشان مي‏دهد که در فاصله‏ي هر دويست و پنجاه تا چهارصد نوکلئوتيد يک SNP وجود دارد(17).
با اينکه‌SNP ها به وفور در ژنوم انسان يافت مي‌شوند، ولي ايجاد و توسعه‌ي نشان‌گرهاي SNP چندان آسان نيست. تهيه نشان‌گر‏هاي SNP شامل مراحل زير است:
1. تعيين رديف DNA اطراف SNP؛
2. تکثير قطعه‌اي منحصر به فرد از DNA به کمک PCR به منظور غربال SNP؛
3. شناسايي SNP که شامل مشاهده‌ي دو آلل در افراد مختلف مي‌باشد؛
4. مکان‌يابي نشان‌گر SNP و تعيين جايکاه خاص کروموزومي آن؛
5. تعيين فراواني دو آلل در جمعيت؛
6. بررسي SNP در افراد و ژنوتيپ‌هاي مختلف(17).
برخي از معايب نشاگرهاي SNP
> SNPها به دليل داشتن فقط دو آلل در يک جايگاه ژني نسبت به نشان‌گر‌هاي چند آللي، اطلاعات کمتري را در نقشه‌هاي پيوستگي نشان مي‌دهند؛
> شناسايي نشان‌گرSNP بسيار پر‌هزينه و هم‌چنين زمان‌بر است(17).
1-3-3-2-4 نشان‌گرهاي مبتني برنقاط نشانمند از رديف(STS)
هر نشان‌گري که مبتني بر واکنش PCR باشد و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي (معمولا بيش از بيست نوکلئوتيد) ايجاد شود، يک نقطه‌ي نشانمند از رديف ناميده مي‏شود، زيرا پيش از طراحي آغازگر، بي‏شک در يک مرحله رديف‌يابي صورت گرفته است. نشان‌گرهايي همچون تفاوت طول قطعه‌هاي قابل تکثير (ALP) و ريزماهواره‏ها از آن جهت که مستلزم رديف‏يابي براي طراحي آغازگر به منظور تکثير DNA در يک نقطه‌ي خاص هستند، ذيل STS دسته‌بندي مي‌شوند:
-تفاوت طول قطعه‏هاي قابل تکثير38(ALP)
-ريز ماهواره‌ها 39(18).
1-3-3-2-4-1 تفاوت طول قطعه‏هاي قابل تکثير(ALP)
ALP يکي از ساده‏ترين و سريع‏ترين نشان‌گرهاي مبتني بر PCR است. اگر رديف باز‏هاي قطعه‏اي از DNA در يک موجود مشخص باشد (يا دست کم بخشي از دو انتهاي آن قطعه معلوم باشد)، براساس آن مي‏توان به طراحي و ساخت مصنوعي آغازگرهايي به طول بيست تا سي نوکلئوتيد اقدام کرد. چنان‌چه نمونه‏هاي مختلف DNA توسط اين آغازگرها و از طريق واکنش زنجيره‏اي پلي‌مراز تکثير و سپس روي ژل الکتروفورز از هم جدا شوند، در صورت وجود اختلاف در طول قطعه‏ي قابل تکثير، باندهايي به اندازه‏هاي مختلف توليد خواهند شد که بيانگر وقوع پديده‏ي حذف يا اضافه40 در بين نمونه‏هاي مورد مطالعه است. اين تفاوت در اندازه‏ي قطعه‏هاي قابل تکثير که جهش‏هاي ژنتيک را نشان مي‏دهد به عنوان نشان‌گرهاي ژنتيک مورد استفاده قرار مي‏گيرد(14).
مزاياي ALP
* از نظر کاربردي در بين نشان‌گرهاي DNA،يکي از سريع ترين و ارزان‌ترين‌ها است؛
* به‌کاربرد مواد پرتوزا يا بيوشيميايي پيچيده نياز ندارد؛
* به‌تدارک، نگهداري و کاربرد کاوشگرها نياز ندارد؛
* بسيار اختصاصي عمل مي‌کند، تکرار پذيري آن خوب است و تا حد بسيار زيادي مي‌توان به نتايج آن اعتماد داشت؛
* به‌مقدار خيلي کمي از DNA نياز است؛
* هم‌بارز بودن اين نشان‌گر امکان تشخيص افراد خالص از هر يک از انواع افراد ناخالص را فراهم مي‌آورد(14).
معايب ALP
> طراحي و ساخت آغازگرها، به اطلاعات اوليه در مورد رديف DNAژنوم مورد مطالعه نياز دارد که با توجه به اينکه ژنوم بسياري از موجودات به طور کامل در دسترس نيست اين روش استفاده بسيار کمي دارد؛
> هزينه‌ي اوليه مورد نياز به منظور توليد تعداد کافي نشان‌گر ژنتيک با توزيع مناسب در سرتاسر ژنوم بسيار زياد و مستلزم صرف وقت است(14).
1-3-3-2-4-2 ريزماهواره‌ها
ريزماهواره‏ها شامل واحدهاي يک الي شش تايي تکرار شونده هستند که در ژنوم بيشتر يوکاريوت‏ها پراکنده‏شده‏اند. به طوري که در هر ده کيلو جفت باز از رديف DNA دست کم يک رديف ريزماهواره‏اي ديده مي‏شود. طول ريز‌ماهواره‏ها معمولا کمتر از 100 جفت باز بوده و توسط دو رديف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده‏اند. ريزماهواره‏ها به سه گروه عمده‌ي تکرارهاي کامل، تکرارهاي ناکامل (معمولا توسط بازهاي غيرتکرارشونده قطع مي‌شوند) و تکرارهاي مرکب(دو يا تعداد بيشتري از واحدهاي مجاور يکديگر) تقسيم مي‏شوند. تعداد تکرارها در هر واحد بسيار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار‌شونده براي ريز ماهواره‏هاي دو نوکلئوتيدي به ترتيب ده و هفت بار تکرار تعيين شده است(21).
مزاياي ريزماهواره‏ها
* کاربرد آنها و تفسير نتايج نسبتا ساده است؛
* سيستم چند آللي(تا 11 آلل) از ويژگي‌هاي بارز اين نوع نشان‌گر است؛
* ريزماهواره‌ها بسيار متنوعند؛
* به وفور در ژنوم يوکاريوت‏ها يافت مي‏شوند؛
* بيشتر ريزماهواره‏ها غير‏عملکردي هستند؛
* همبارز هستند [22].
1-4 فراواني، توزيع و سازماندهي ريزماهواره‏ها در داخل ژنوم
ريزماهواره‌ها بسيار فراوان بوده و در کل ژنوم موجودات به صورت تصادفي پراکنده اند. فراواني ريزماهواره ها در بين موجودات زنده متفاوت است. براي مثال تخمين زده شده است که ژنوم انسان به طور ميانگين ده برابر بيشتر از گياهان ريزماهواره دارد. علاوه برDNA کروموزومي تعداد زيادي ريزماهواره در DNA کلروپلاست ها نيز گزارش شده است. به کمک روش‏هايي از قبيل دورگه‏گيري در ژل، نقشه‏يابي ژنتيکي و فيزيکي و هم چنين دورگه‏گيري در محل41 فلورسنت، ثابت شده است که ريزماهواره ها به طور يکنواخت در ژنوم پراکنده‏اند. اگرچه در برخي موارد مي توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند(12).
1-5 مکانيسم ايجاد تنوع در طول توالي‏هاي تکراري
چنين فرض مي‏شود که جهش در تعداد واحدهاي تکرار شونده در هر يک ازDNA هاي تکرار شونده با يکي از دو سازوکار کراسينگ آور نامساوي42(uco) يا جفت نشدن ناشي از سرخوردن در طول رشته43 (خطاي همانندسازي44 DNA ) صورت مي‏گيرد. بيشتر عقيده بر اين است که ريزماهواره‏ها و ماهواره‏ها توسط سازوکار کراسينگ آور نامساوي ايجاد مي‏شوند، ولي در مورد ريزماهواره‏ها برخي افراد يکي از دو سازوکار و برخي ديگر هر دو سازوکار را موثر مي‏دانند(23).
1-5-1 کراسينگ اور نابرابر


پاسخ دهید