2-4-1. فارماكوكينتيك دارو35
2-4-2. مكانيسم اثر دارو35
2-4-3. موارد مصرف دارو36
2-4-4. منع مصرف و احتياط36
2-4-5. عوارض جانبي36
2-4-6. تداخلات36
2-4-7- دوز مصرفي36
2-5. اهميت اندازه‌گيري رالوکسيفن37
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1. مواد شيميايي و تجهيزات دستگاهي39
3-1-1. مواد شيميايي، استانداردها و نمونه‌هاي حقيقي39
3-1-2. تجهيزات دستگاهي39
3-2. روش استخراج40
3-2-1. استخراج به اختصار طي مراحل زير انجام گرفت:41
3-2-2. مراحل بهينه‌سازي42
3-2-2-1. بهينه‌سازي شرايط جداسازي42
3-2-2-2. بهينه‌سازي شرايط استخراج42
3-2-2-2-1. نوع حلال آلي43
3-2-2-2-2. اثر pH فاز دهنده43
3-2-2-2-3. اثر pH فاز گيرنده43
3-2-2-2-4. اثر قدرت يوني فاز دهنده43
3-2-2-2-5. اثر همزدن محلول آناليت43
3-2-2-2-6. اثر زمان استخراج43
3-2-2-2-7. اثر دما بر استخراج43
3-2-3. ارزيابي كارايي روش استخراج44
3-2-3-1. منحني درجه‌بندي44
3-2-3-2. تعيين فاكتور پيش تغليظ (PF)44
3-2-3-3. تعيين تكرارپذيري (RSD)45
3-2-4. آناليز نمونه حقيقي45
فصل چهارم: نتايج
4-1. ميكرواستخراج سه فازي بر پايه استفاده از فيبر توخالي متخلخل47
4-1-1. اصول تئوري47
4-2. مراحل بهينه‌سازي50
4-2-1. بهينه‌سازي شرايط جداسازي50
4-2-2. بهينه‌سازي شرايط استخراج51
4-2-2-1. نوع حلال آلي51
4-2-2-2. اثر pH فاز گيرنده و فاز دهنده53
4-2-2-3. اثر سرعت هم‌زدن محلول آناليت55
4-2-2-4. اثر قدرت يوني فاز دهنده57
4-2-2-5. اثر زمان استخراج58
4-2-2-6. اثر دماي استخراج59
4-3. تعيين پارامترهاي تجزيه‌اي روش استخراج60
4-3-1. تهيه منحني درجه‌بندي61
4-3-2. فاكتور پيش تغليظ (PF) و درصد بازيابي (R%)61
4-3-3. تعيين حد تشخيص (LOD)63
4-3-4. تكرارپذيري روش (RSD)63
4-4- آناليز نمونه حقيقي64
فصل پنجم: بحث و نتيجه‌گيري
5-1. مقايسه روش استخراجي با روش‌هاي گزارش شده‌ي ديگر مراجع66
5-2. نتيجه‌گيري69
منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………70
خلاصه انگليسي…………………………………………………………………………………………………………………83
ضمائم………………………………………………………………………………………………………………………………..84
عنوان فهرست جداول صفحه
جدول 1-2: کاربردهاي کروماتوگرافي تقسيمي ……………………………………………………………………………………………23
جدول 2-2: کاربردهاي اخير HF-LPME در استخراج ……………………………………………………………………………33
جدول 4-1: خلاصه نتايج بهينه سازي فرآيند استخراج ……………………………………………………………………………….59
جدول 4-2: ارقام شايستگي HF-LPME داروي رالوکسيفن …………………………………………………………………….63
جدول 4-3: نتايج اندازه گيري رالوکسيفن در پلاسما …………………………………………………………………………………..65
جدول 5-1: کارهاي انجام شده بر روي رالوکسيفن ………………………………………………………………………………………67
عنوان فهرست نمودارها صفحه
نمودار 4-1: بررسي نوع حلال آلي پرکننده منافذ فيبر توخالي ……………………………………………………………………53
نمودار 4-2: بررسي تغييرات pH فاز دهنده درفرآيند استخراج …………………………………………………………………..54
نمودار 4-3: بررسي تغييرات pH فاز گيرنده درفرآيند استخراج ………………………………………………………………….55
نمودار 4-4: اثر سرعت همزدن بر فرآيند استخراج ……………………………………………………………………………………….56
نمودار 4-5: تاثير قدرت يوني فاز دهنده بر فرآيند استخراج ………………………………………………………………………..57
نمودار 4-6: تاثير زمان برفرآيند استخراج ……………………………………………………………………………………………………..58
نمودار 4-7: تاثير دما برفرآيند استخراج ………………………………………………………………………………………………………..59
نمودار 4-8: منحني درجه بندي نمونه در محيط آبي ………………………………………………………………………………….60
نمودار 4-9: منحني درجه بندي نمونه در تزريق مستقيم …………………………………………………………………………….62

عنوان فهرست اشکال صفحه
شکل 1-1: روش هاي مختلف استخراج و ميکرو استخراج ……………………………………………………………………………..4
شکل 2-1: نماي جانبي از سيستم ميکرواستخراج با حلال با استفاده از ميله تفلني …………………………………….9
شکل 2-2: نمايي از سيستم ميکرو استخراج با تک قطره …………………………………………………………………………….11
شکل 2-3: اصول استخراج HF-LPME …………………………………………………………………………………………………….13
شکل 2-4: سيستم HF-LPME براساس پيکربندي U شکل و ميله اي …………………………………………………16
شکل 2-5: طرح شماتيک از سيستم HF-LPME …………………………………………………………………………………….17
شکل 2-6: شمايي از سيستم HF-LPME و سيستم نيمه خودکار ………………………………………………………….17
شکل 2-7: طرح شماتيک ميکرواستخراج فاز مايع ……………………………………………………………………………………….20
شکل 2-8: شمايي از دستگاه HPLC ………………………………………………………………………………………………………….25
شکل 2-9: يک حلقه نمونه برداري کروماتوگرافي مايع ………………………………………………………………………………..27
شکل 2-10: نسلول آشکارساز فرابنفش براي HPLC ………………………………………………………………………………..31
شکل 2-11: ساختار شيميايي مولکول رالوکسيفن …………………………………………………………………………………..35
شکل 3-1: تصوير سيستم استخراج استفاده شده در آزمايشگاه …………………………………………………………………..42
شکل 4-1: کروماتوگرام تزريق محلول آبي رالوکسيفن در شرايط بهينه استخراج …………………………………..51
شکل 4-2: کروماتوگرام هاي نمونه پلاسما ……………………………………………………………………………………………………64
خلاصه فارسي
رالوکسيفن براي درمان سرطان پستان و نازايي وابسته به‌اوليگومنوره يا آمنوره ثانويه مصرف‌ مي‌شود. رالوكسيفن درمان جديدي است كه اخيراً براي پيشگيري از پوكي استخوان ستون فقرات در دسترس قرار گرفته است. اين دارو به صورت روزي يك قرص مصرف مي‌گردد. از بعضي جهات اين دارو شبيه استروژن عمل مي‌كند، اما برخلاف آن باعث خونريزي از مهبل يا افزايش خطر ابتلاء به سرطان پستان نميشود.
در واقع شواهدي وجود دارد كه اين دارو خانمها را از ابتلاء به سرطان پستان در حداقل سه سال اول شروع درمان محافظت مي‌كند. رالوكسيفن در برطرف كردن مشكلات يائسگي خانمها مثل برافروختگي، احساس داغ شدن و عرق ريزش شبانه كمكي نمي‌كند.
مكانيسم اثر: رالوکسيفن از گروه داروهاي SERM(تعديل کننده هاي انتخابي گيرنده استروژن) مي باشد. اين داروها در برخي بافت ها اثرات مشابه استروژن ( آگونيستي)، و در ساير بافت ها داراي اثرات مشابه نسبي و يا جلوگيري از اثر استروژن (آنتاگونيستي) دارند. رالوکسيفن در درمان سرطان هاي پاسخ دهنده به هورمون تجويز مي شود و در اين بافت به عنوان آنتاگونيست از فعال شدن گيرنده توسط استروژن هاي آندوژن جلوگيري مي کند.
عوارض جانبي: گر گرفتگي، خونريزي واژن، توقف قاعدگي، خارش فرج، اختلالات گوارشي، التهاب تومور، کاهش تعداد پلاکتها، احتباس مايعات، طاسي، فيبروم رحم، اختلالات بينايي (تغييرات قرنيه، آب مرواريد و رتينوپاتي‌) کاهش پلاکت‌ها يا گلبول‌هاي سفيد خون، به‌ندرت کاهش نوتروفيل‌ها و تغييرات آنزيم‌هاي‌کبدي از عوارض جانبي دارو هستند.
در اين مطالعه يك روش ميكرواستخراج فاز مايع با استفاده از فيبر توخالي به همراه كروماتوگرافي مايع با عملكرد بالا (HPLC) و دتکتور UV جهت پيش تغليظ و شناسايي رالوکسيفن در پلاسما به كار برده شد. رالوکسيفن از 15 ميلي‌ليتر محلول بازي نمـونـه بـا 11= pH بـه داخـل يـك حـلال آلـي( اکتانول) كه در منافذ ديواره فيبر قرار داشت استخراج شد. به دنبال آن اين دارو از حلال آلي به داخل فاز گيرنده آب با ماهيت اسيدي با 5/2pH= كه در داخل فيبر قرار داشت وارد شد. در ادامه فاكتورهاي موثر در ميكرواستخراج كه شامل pH فاز دهنده و فاز گيرنده، نوع حلال آلي، قدرت يوني فاز دهنده، زمان استخراج سرعت هم‌زدن بررسي و بهينه شد. پس از استخراج دارو با شرايط بهينه فاكتور پيش تغليظ 108درصد بازيابي 81 درصد حد تشخيص 3/0 نانوگرم بر ميلي ليتر، محدود خطي بودنng/ mL 100-1 با 99/0R2= و %35/3 RSD = حاصل شد.
کليد واژه: ميکرواستخراج، هالوفايبر، پيش تغليظ، فيبر توخالي، رالوکسيفن.
مقدمه
علم شيمي تجزيه روش‌هاي متنوعي را براي آناليز كمي و كيفي مواد ارائه مي‌دهد. امروزه روش‌هاي جداسازي، تفكيك گونه‌اي موجود در بافت‌هاي پيچيده را با حد تشخيصي در حد خيلي كم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روش‌هاي جداسازي، مرحله‌ي آماده‌سازي نمونه نيز يكي از مهم‌ترين مراحل در روند تجزيه مي‌باشد. اين مرحله شامل تبديل بافت يك نمونه حقيقي به حالتي است كه براي تجزيه با يك تكنيك جداسازي و يا روش‌هاي ديگر مناسب باشد. مي‌توان گفت مرحله آماده‌سازي نمونه براي اهداف زير طراحي شده است:
1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزايش گزينش‌پذيري روش
2- پيش تغليظ آناليت مورد نظر و افزايش غلظت آن به نحوي كه بتوان آنرا با دستگاه‌هاي تجزيه‌اي اندازه‌گيري كرد.
3- تبديل آناليت‌ها به فرمي كه براي شناسايي با دستگاه تجزيه‌اي مناسب باشد.
اساسي‌ترين روش آماده‌سازي نمونه، روش استخراج است. تلاش متخصصين شيمي تجزيه براي ابداع و توسعه‌ي روش‌هاي اندازه‌گيري با دقت و صحت بالا و نيز حذف مراحل دستي كه موجب تكرارپذيري پايين در روش‌هاي تجزيه‌اي مي‌شود، باعث شده كه روش‌هاي استخراجي نويني ابداع گردد. شكل (1-1) روش‌هاي مختلف استخراج و ميكرواستخراج را دسته‌بندي مي‌كند كه راجع به آنها توضيحات مفصلي در مراجع آمده است.
در كليات به اختصار راجع به ميكرواستخراج مايع- مايع با قطره روش‌هاي استخراج بر پايه استفاده از فيبرهاي توخالي متخلخل بحث خواهد شد.
شكل (1-1). روش‌هاي مختلف استخراج و ميكرواستخراج
فصل اول
كليات
1-1. بيان مساله
جهت اندازه‌گيري مقادير Trace رالوکسيفن در مايعات بدن مي‌بايست از متدي استفاده شود كه به تيم پزشكي در تنظيم دوز دارو بدون نياز به خون‌گيري و از طريق غير تهاجمي كمك كند و قدرت شناسايي و تفكيك اين دارو را داشته باشد. با استفاده از متد پيش تغليظ دارو با ميكرواستخراج فاز مايع به كمك هالوفايبر مي‌توان مقادير بسيار كم اين دارو را در پلاسما تغليظ و استخراج نمود، سپس با دستگاه HPLC اندازه‌گيري كرد. از آنجا كه دفع اين دارو کبدي است و فقط 6 درصد از راه ادرار دفع ميشود در افراد با نارسايي کبدي دوز دارو 2.5 برابر ميشود در افراد با نارسايي کليوي کليرانس 15 درصد افزايش مي يابد و با توجه به نيمه عمر آن، مي‌توان از نمونه پلاسما افراد جهت آناليز استفاده نمود. اين روش بسيار جديد بوده و تا به حال جهت پيش تغليظ و اندازه‌گيري اين دارو استفاده نشده است.
1-2. اهداف
ابداع روش جديد و غير تهاجمي (non invasive) جهت تعيين مقدار اين دارو از طريق بهينه‌سازي پارامترهاي موثر در پيش تغليظ و اندازه‌گيري اين دارو و در نهايت دستيابي به دوز تجويزي مناسب در كساني كه دارو را دريافت مي‌كنند.

فصل دوم
بررسي متون و مطالعات ديگران در اين زمينه
2-1. مروري بر روش‌هاي استخراج مايع- مايع و ميكرواستخراج مايع- مايع1
استخراج مايع- مايع بر مبناي توزيع گونه بين دو فاز امتزاج‌ناپذير كه معمولاً يكي از آن‌ها آب و ديگري يك حلال آلي است استوار است. در اين روش اساس جداسازي توزيع است ]12[.
عوامل موثر در استخراج مايع- مايع عبارتند از:
نوع حلال استخراج كننده، حجم حلال آلي براي استخراج، pH، عامل استخراج، عامل پوشاننده و قدرت يوني محيط.
استخراج مايع- مايع يكي از قديمي‌ترين روش‌هاي جداسازي است، سادگي و كاربردي بودن در مقياس تجزيه‌اي و صنعتي از عوامل بقاي اين روش تا امروزه بوده است. از مهم‌ترين معايب اين روش مصرف زياد حلال آلي و آلودگي محيط زيست، هزينه حلال آلي و ايجاد سميت مي‌باشد. در همين راستا با پيشرفتي كه در اين روش صورت گرفت و با كم كردن مقدار حلال آلي استخراجي، روش‌هاي ميكرواستخراج با حلال روي كار آمدند كه در اين روش‌ها حجم حلال آلي مصرفي به مقدار قابل توجهي كاهش مي‌يابد ]29[.
روش‌هاي ميكرواستخراج با حلال شامل موارد زير مي‌باشد:
ميكرواستخراج فاز مايع با تك قطره2 (SDME)
ميكرواستخراج فاز مايع توسط غشاي فيبر توخالي3(HF-LPME)
ميكرواستخراج فاز مايع با استفاده از انجماد حلال استخراج كننده
ميكرواستخراج فاز مايع- مايع پخشي4 (DLPME)
2-1-1. ميكرواستخراج فاز مايع
2-1-1-1. ميكرواستخراج فاز مايع با تك قطره
Liu و Dasgupta اولين محققاني بودند كه از يك قطره‌ي كوچك جهت تغليظ و استخراج استفاده نمودند. آنها با به كار بردن يك ميكرو قطره‌ي آلي از جنس كلروفرم به صورت معلق در يك قطره آبي در حال جريان (سيستم قطره در قطره) توانستند سديم دو دسيل سولفات را به صورت زوج يون با متيلن بلو به داخل كلروفرم استخراج نمايد ]12[. تقريباً در همان زمان jeannot و cantwell روشي را معرفي كردند كه آن ميكرواستخراج با حلال ناميدند ]37[. در اين روش يك قطره 8 ميكروليتري از حلال آلي n- اكتان حاوي مقدار ثابتي از استاندارد داخلي در انتهاي ميله‌ي تفلوني قرار مي‌گرفت و ميله‌ي تفلوني به محلول آبي در حال چرخش كه حاوي آناليت بود وارد مي‌شد. بعد از اتمام استخراج، ميله تفلوني از محلول آبي بيرون كشيده شده و 1 از فاز آلي براي آناليز به دستگاه كروماتوگرافي گازي تزريق مي‌گرديد (شكل 2-1).
شكل (2-1). نماي جانبي از سيستم ميكرواستخراج با حلال با استفاده از ميله‌ي تفلوني
در سال 1997 به موازات تحقيقات Jeannot و Cantwell روي ميكرواستخراج با قطره He ]44[ و Lee استخراج با قطره را در حالت استاتيك و ديناميك انجام دادند. در روش استاتيك، يك ميكروليتر از قطره‌ي استخراجي در نوك سوزن ميكروسرنگ معلق شده، در تماس با محلول آبي قرار گرفته و استخراج گونه از فاز آبي به داخل قطره انجام مي‌گيرد. در روش ديناميك، پيستون ميكروسرنگ به صورت قيف جدا كننده عمل مي‌نمايد. با كشيدن پيستون و ورود محلول آبي به داخل ميكروسرنگ، لايه‌ي نازكي از فاز آلي در جدار داخلي سرنگ و سوزن تشكيل شده و همرفت القاء شده در اثر حركت پيستون منجر به استخراج گونه‌ها از فاز آبي به لايه آلي مي‌گردد ]31[. ميكرواستخراج با قطره به دو شيوه دو فازي و سه فازي قابل انجام است. در ميكرواستخراج دو فازي، استخراج گونه‌ها به درون يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب رخ مي‌دهد. در ميكرواستخراج سه فازي يا ميكرواستخراج مايع- مايع- مايع5، گونه‌ها از نمونه به درون حلال آلي و سپس با استخراج برگشتي به درون فاز آبي پذيرنده استخراج مي‌شوند.
در ميكرواستخراج با قطره (دو فازي يا سه فازي) به دليل انتقال گونه‌ها از نمونه‌هاي با حجم چند ميلي‌ليتر به داخل ميكرو قطره‌اي با حجم ميكروليتر، فاكتور تغليظ بالايي براي مواد مختلف به دست مي‌آيد. وجود يك مرحله استخراج برگشتي در سيستم سه فازي، انتخابگري سيستم را بالا مي‌برد، چرا كه طي آن بسياري از مولكول‌هاي خنثي حذف گرديده و روش از قدرت پاكسازي6 بالايي براي نمونه‌هاي با ماتريس پيچيده برخوردار مي‌گردد. با انتخاب حلال آلي مناسب، كاهش نسبت حجم ميكرو قطره‌ي پذيرنده به نمونه، تنظيم شرايط و pH فازهاي دهنده و گيرنده و نيز با بكارگيري واكنش‌گرهاي كمكي در فاز استخراجي به منظور به دام اندازي گونه‌ها، مي‌توان كارايي استخراج را افزايش داد ]30[.
قرارگيري حلال استخراجي در معرض بافت پيچيده‌ي نمونه و انحلال جزيي حلال در آب، دشواري نگهداري قطره درون محلول، عدم امكان استفاده از دماهاي بالا و ناپايدار شدن قطره طي هم‌زدن محلول، همچنين كشيده شدن مقداري از محلول همراه با قطره به درون ميكروسرنگ در انتهاي كار از جمله معايب روش SDME مي‌باشد. Jeannot و همكارانش در سال 2001 با هدف رفع اين محدوديت‌ها ايده‌ي استفاده از قطره‌ي حلال در فضاي فوقاني7 را مطرح نمودند ]66[.
در اين روش كه ميكرواستخراج با حلال از فضاي فوقاني ناميده مي‌شود، قطره براي زماني معلوم در تماس با فضاي فوقاني نمونه قرار گرفته و استخراج گونه‌ها از محلول به فضاي فوقاني و از آنجا به درون قطره انجام مي‌پذيرد.
HS-SDME روشي ساده، حساس و ارزان است و جهت استخراج تركيبات فرار و نيمه فرار از نمونه‌هاي با بافت پيچيده بسيار مناسب مي‌باشد ]73، 46[ به منظور افزايش تكرارپذيري استخراج، اين روش توسط دستگاه‌هاي نيمه خودكار و تمام خودكار نيز انجام پذيرفته است. در شكل (2-2) نمايي از سيستم ميكرواستخراج با قطره به دو شيوه استخراج مستقيم و استخراج از فضاي فوقاني نشان داده شده است.
(شكل 2-2). نمايي از سيستم ميكرواستخراج با تك قطره الف) استخراج مستقيم از درون محلول ب) استخراج از فضاي فوقاني
2-1-1-2. ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي (HF-LPME)
روش LPME با تك قطره به صورت دو فازي و سه فازي از مزايايي همچون مصرف مقادير بسيار كم از نمونه و حلال آلي، حساسيت و فاكتور تغليظ بالا، قابليت انجام به صورت استاتيك و ديناميك و قدرت پاكسازي بسيار مطلوب براي نمونه‌هاي پيچيده برخوردار است.
مهم‌ترين عيب روش از آنجا ناشي مي‌شود كه نگه‌داري قطره‌ي استخراجي در انتهاي ميكروسرنگ بويژه براي زمان‌هاي طولاني و تحت هم‌زدن شديد محلول دشوار بوده و به شرايط و مهارت خاصي نيازمند است. به منظور غلبه بر مشكلات فوق و نيز استفاده از فازهاي گيرنده‌اي با حجم بيشتر Rasmussen و Pedersen-Bjergaard در سال 1999 استفاده از فيبرهاي توخالي متخلخل از جنس پلي‌پروپيلن را به عنوان نگهدارنده‌اي جهت حفظ مكانيكي فاز استخراجي پيشنهاد نمودند كه تحت عنوان ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي نام گرفت ]41، 79[ در واقع تكنيك HF-LPME، نوعي روش ميكرواستخراج با غشاي مايع نگهداري شده مي‌باشد8 كه در آن حلال آلي توسط نيروهاي كاپيلاري درون منافذ فيبر قرار مي‌گيرد و لايه نازكي را نيز روي ديواره‌ي فيبر تشكيل مي‌دهد. فاز استخراجي كه در حد چند ميكروليتر مي‌باشد داخل مجراي دروني فيبر وارد مي‌گردد. حجم فاز آلي مورد استفاده در اين روش در قياس با روش سه فازي LPME با قطره كمتر بوده و از سويي امكان تشكيل امولسيون كه از مشكلات متداول روش LLE است، حذف مي‌گردد.
2-1-1-2-1. اصول استخراج و سيستم‌هاي مختلف در استفاده از HF-LPME ]53[

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

شكل (2-3)، اصول روش ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي را نشان مي‌دهد. محلول آبي نمونه درون يك ظرف كوچك پر مي‌شود و تكه‌اي از يك فيبر توخالي از جنس پلي‌پروپيلن متخلخل درون نمونه قرار داده مي‌شود. حجم نمونه آلي معمولاً در حد چند ميلي‌ليتر و طول فيبر، بسته به نوع كاربرد، در حد چند سانتي‌متر است. پيش از استخراج، فيبر در يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب آغشته مي‌شود تا حلال منافذ فيبر را پر كند. بدين ترتيب، لايه نازكي از حلال آلي در جداره‌ي فيبر، كه معمولاً 200 ضخامت دارد، تشكيل مي‌شود. حجم كلي حلال آلي تثبيت شده در غشاء معمولاً 20-15 مي‌باشد. براي گونه‌هاي قابل يونيزاسيون، pH محلول به گونه‌اي تنظيم مي‌شود كه گونه‌ها به شكل غير يوني خود وجود داشته باشند تا حلاليت‌شان در نمونه آبي كم شود و قابليت استخراج‌پذيري آنها به درون حلال آلي افزايش يابد. بدين ترتيب، گونه‌هاي موجود در نمونه‌ي آبي از ميان فاز آلي تثبيت شده در غشاي فيبر به درون محلول گيرنده موجود در مجراي دروني فيبر استخراج مي‌شوند. براي تسريع اين فرآيند، هم‌زدن و چرخش سريع نمونه به كار گرفته مي‌شود. محلول گيرنده مي‌تواند از جنس همان حلال آلي تثبيت شده در منافذ غشاي فيبر باشد كه در اين صورت تشكيل يك سيستم دو فازي را مي‌دهد و گونه‌ها در يك فاز آلي استخراج مي‌شود ]56، 57[. ميكرواستخراج فاز مايع با سيستم دو فازي بيشتر براي گونه‌هايي به كار گرفته مي‌شود كه حلاليت‌شان در يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب به ميزان قابل توجهي بيشتر از محيط آبي است. در اين روش، فاز استخراجي مستقيماً با GC سازگار است، در حالي كه براي آناليز با HPLC يا CE9 به تبخير حلال و تركيب دوباره در محيط آبي نيازمند مي‌باشد.
شكل (2-3). اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازي (ب) سه فازي
در سيستم سه فازي، محلول گيرنده فاز آبي ديگري است كه در آن گونه موجود در نمونه آبي از طريق فيلم نازكي از حلال آلي در غشا به درون محلول آبي پذيرنده استخراج مي‌شود. اين شيوه استخراجي به گونه‌هاي بازي و اسيدي با گروه‌هاي عاملي يونيزه شونده محدود مي‌شود. براي استخراج تركيبات بازي، pH نمونه بايستي در ناحيه قليايي تنظيم شود تا از حلاليت آناليت جلوگيري كند. در حالي كه pH محلول گيرنده بايد پايين باشد تا اينكه حلاليت گونه در آن افزايش يابد. در اين صورت گونه‌ها به شكل خنثي وارد فاز آلي شده و مجدداً با تبديل به شكل يوني به فاز گيرنده، استخراج مي‌شوند. در مورد تركيبات اسيد pH فاز دهنده در ناحيه اسيدي و pH فاز گيرنده در ناحيه قليايي تنظيم مي‌شود. در نهايت فاز استخراجي مستقيماً مي‌تواند به دستگاه‌هاي CE، HPLC و يا LC-MS تزريق گردد.
ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي به شكل ديناميك هم مي‌تواند انجام شود. در سيستم دو فازي، يك ميكروسرنگ با چند ميكروليتر از حلال آلي غير قابل امتزاج با آب پر مي‌شود ]81[. تكه كوچكي از فيبر توخالي به سوزن ميكروسرنگ متصل شده، فيبر توخالي براي چند ثانيه داخل حلال آلي گذاشته مي‌شود تا منافذ فيبر از حلال آلي پر شود. سپس سوزن سرنگ به همراه فيبر در نمونه آبي قرار داده مي‌شود و در طول استخراج، حجم‌هاي كوچكي از نمونه آبي به طور پي در پي به درون فيبر كشيده و خالي مي‌شود. در طي كشيدن نمونه آبي به درون سرنگ، فيلم نازك حلال آلي در جداره فيبر شديداً آناليت را از محلول نمونه استخراج مي‌كند، در حالي كه در طي بيرون راندن نمونه، اين فيلم نازك دوباره با فاز آلي درون سرنگ تركيب مي‌شود. در طول فرآيند تركيب شدن دوباره حلال، بخشي از گونه‌ي استخراج شده در طول چرخه، در حلال آلي داخل توده10 فيبر توخالي به دام مي‌افتد. پس از استخراج گونه‌ها طي چرخه‌هاي متوالي، بخشي از حلال آلي موجود در سرنگ براي آناليز به دستگاه كروماتوگرافي تزريق مي‌شود. سيستم سه فازي ديناميك نيز گزارش شده است كه البته مشابه روش دو فازي مي‌باشد. در اين روش، ابتدا ميكروسرنگ با چند ميكروليتر از محلول آبي پذيرنده و به دنبال آن با چند ميكروليتر از حلال آلي پـر مـي‌شـود. مابقي فرآيند مشابه روش دو فـازي مـي‌بـاشـد. HF-LPME ديناميك در مقايسه با سيستم‌هاي استاتيك سرعت استخراج را افزايش مي‌دهد، اما در عمل روش ديناميك پيچيده‌تر است و پارامترهاي تجربي بيشتري بايد كنترل و بهينه شوند ]24، 25[.
علاوه بر دو سيستم HF-LPME اشاره شده كه معمولاً براساس گراديان pH و يا انتقال توسط حامل مي‌باشد، اخيراً روش HF-LPME با اعمال يك ميدان الكتريكي در دو سمت غشا انجام گرفته و تحت عنوان جداسازي الكتريكي غشا11نام گرفته است. در اين روش، نيروي محرك براي استخراج گونه‌ها اختلاف پتانسيل است و گراديان pH نقشي در استخراج ندارد ]75[.
در تحقيقاتي كه توسط Lee انجام گرفت، وي روش جديدي را بر مبناي فيبر توخالي به نام ميكرواستخراج سه فازي مايع- گاز- مايع12 ابداع نمود. در اين روش گونه‌ها در اثر حرارت از محلول به جداره فيبر پر شده با هوا نفوذ كرده و سپس به دليل pH خاص فاز گيرنده، در شكل يوني خود به درون فاز گيرنده استخراج مي‌شوند. مزيت اين روش اين است كه هيچ گونه حلال آلي در آن استفاده نمي‌شود.

2-1-1-2-2. جنبه‌هاي عملي و پيكربندي‌هاي مختلف HF-LPME
تا كنون اغلب كاربردهاي HF-LPME بر اساس فيبرهاي پلي‌پروپيلن بوده است، ولي استفاده از فيبر متخلخل پلي‌وينيليدين دي‌فلوئورايد13 هم گزارش شده است. دليل اين امر، سازگاري بيشتر پلي‌پروپيلن با گستره وسيعي از حلال‌هاي آلي بوده است. به علاوه، پلي‌پروپيلن با اندازه‌ي منافذ تقريباً 2/0 به خوبي مي‌تواند حلال‌هاي آلي در فيبر در فرآيند LPME تثبيت كند، كه اين موضوع براي جلوگيري از نشت حلال به درون نمونه مهم مي‌باشد. اين مساله مخصوصاً در مورد محلول‌هايي كه به شدت هم‌زده مي‌شوند و نمونه‌هايي مانند پلاسما كه با حلال تشكيل امولسيون مي‌دهند، داراي اهميت است. قطر دروني فيبرهاي مورد استفاده معمولاً در محدود1200-600 مي‌باشد، ولي گزارشاتي نيز در زمينه استفاده از فيبرهاي توخالي با قطر دروني كمتر، تا حد 280 وجود دارد. در گزينش فيبر بايد ضخامت ديواره آن زياد نباشد تا فاصله انتشار در فيبر كوتاه بوده و سرعت استخراج افزايش يابد. فيبرهاي با ضخامت ديواره‌ي خيلي كم استحكام فيزيكي كافي ندارند و در مقابل استفاده از فيبرهاي با ضخامت بيشتر نيز به دليل افزايش حجم و ضخامت لايه‌ي آلي، منجر به زمان‌هاي استخراج طولاني‌تر و كاهش كارايي سيستم مي‌شود. از اين رو معمولاً ضخامت ديواره‌ي 200 براي اين منظور مناسب است. در اكثر موارد از فيبري با جنس پلي‌پروپيلن با قطر دروني 600، ضخامت ديواره‌ي 200 و اندازه منافذ 2/0 استفاده مي‌شود ]25، 79[.
در كار عملي با فيبر توخالي پيكربندي‌هاي14 مختلفي از HF-LPME به كار مي‌رود. اولين كار در زمينه ميكرواستخراج با فيبر توخالي با پيكربندي فيبر به صورت U شكل، توسط Rasmussen و Pedersen-Bjergaard معرفي گرديد ]79[. در اين تحقيق، قطعات 5/8 سانتي‌متر از فيبر توخالي پلي‌پروپيلني با قطر داخلي 600، ضخامت ديواره‌ي 200 و اندازه منافذ 2/0 براي استخراج بريده و استفاده شده‌اند. هر انتهاي فيبر به يك سوزن ميكروسرنگ متصل شد كه يكي از اين سرنگ‌ها براي ورود فاز گيرنده و ديگري براي كشيدن فاز گيرنده در انتهاي استخراج به كار گرفته شد. براي خروج فاز گيرنده يك فشار فوقاني كوچك روي سوزن اول اعمال مي‌شود و جمع‌آوري فاز گيرنده از لوله خروجي صورت مي‌گيرد ]79[. در پيكربندي U شكل كارايي استخراج مناسب است، ولي در مقابل روش انتقال فاز گيرنده و خودكار كردن15 سيستم مشكل مي‌باشد ]79[. براي رفع اين مشكل، پيكربندي ميله‌اي توسط Rasmussen و Pedersen-Bjergaard و سپس Andrews, Kramer ]33[ پيشنهاد گرديد. شكل (2-4) پيكربندي U شكل و ميله‌اي را نشان مي‌دهد. در پيكربندي ميله‌اي به منظور تسهيل در ورود و خروج ميكروسرنگ، قطعه‌اي مخروطي به نوك فيبر متصل مي‌شود كه امكان ورود و خروج فاز استخراجي را توسط ميكروسرنگ ساده‌تر مي‌سازد. اين تكنيك قابليت سازگاري بيشتري با نمونه‌برداري خودكار دارا مي‌باشد.

شكل (2-4). (الف) سيستم HF-LPME براساس پيكربندي U شكل ]79[ (ب) پيكربندي ميله‌اي ]77[
به دنبال آن، تكنيك ديگري توسط Muller و همكارانش ارائه شد كه در اين تكنيك به يك انتهاي فيبر وسيله‌اي قيف مانند كه از جنس فولاد زنگ نزن متصل مي‌شود كه محل تزريق است. يك پيچ كوچك در محل تزريق براي نگهداري انتهاي باز فيبر به كار گرفته مي‌شود و تنها از يك ميكروسرنگ براي ورود و خروج فاز گيرنده استفاده مي‌شود. باز بودن بخش انتهايي فيبر، مشكلاتي مانند ايجاد حباب هوا طي كشيدن فاز گيرنده را رفع مي‌كند. در پايان، پس از استخراج يك نمونه‌بردار خودكار مي‌تواند فاز استخراجي را به دستگاه GC تزريق كند.
اخيراً پيكربندي ساده‌تري ارائه گرديده كه شامل اتصال مستقيم فيبر به نوك سوزن ميكروسرنگ مي‌باشد (2-5). در اين تكنيك، طول مشخصي از فيبر پس از بسته شدن انتهاي آن با حرارت، به سوزن ميكروسرنگ كه حاوي محلول استخراجي است، متصل شده و پس از آغشته نمودن جدار فيبر با حلال آلي و تزريق محلول استخراجي به داخل فيبر، محلول استخراج كننده به داخل ميكروسرنگ كشيده و سپس به دستگاه كروماتوگرافي تزريق مي‌شود. شماي اين سيستم در شكل (2-5) نشان داده شده است.

شكل (2-5). طرح شماتيك از سيستم HF-LPME
اين پيكربندي بدون بستن انتهاي فيبر جهت انجام استخراج به صورت ديناميك به كار گرفته شده كه در آن يك پمپ سرنگي به طور خودكار پيستون ميكروسرنگ را بالا و پايين مي‌كشد تا استخراج انجام شود ]57[.
قابل ذكر است كه كاربرد فيبر توخالي براي استخراج از حجم زيادي از نمونه در حد 1 ليتر (180) و نيز كاربرد آن به صورت نيمه خودكار نيز عملي شده است، به طوري كه در آنها يك يا دو مرحله‌ي استخراج مي‌تواند به صورت خودكار انجام گيرد. شكل (2-6) استخراج از حجم بالاي نمونه و همچنين سيستم نيمه خودكار استخراجي را نشان مي‌دهد.

شكل (2-6). (الف) شمايي از سيستم HF-LPME از حجم زياد و (ب) سيستم نيمه خودكار
با پيشرفت‌هاي سريع در اين زمينه pawliszyn و همكارانش در سال 2006 موفق به معرفي سيستم تمام خودكار HF-LPME شدند.
2-1-1-2-3. ميكرواستخراج فاز مايع از فضاي فوقاني با فيبر توخالي
نمونه‌برداري از فضاي فوقاني روش موفقي براي استخراج تركيبات فرار و نيمه فرار از نمونه‌هاي پيچيده است، به طوري كه در آن گونه‌ها ابتدا از نمونه جامد يا مايع خود به فضاي فوقاني نمونه انتقال مي‌يابند، سپس نمونه‌برداري و اندازه‌گيري انجام مي‌گيرد. بديهي است كه گونه‌هايي به اين روش قابل اندازه‌گيري هستند كه فراريت لازم جهت انتقال به فضاي فوقاني را داشته باشند. روش‌هاي نمونه‌برداري از فضاي فوقاني داراي حساسيت كمي هستند، مگر اينكه روش‌هاي مختلف ميكرواستخراج از فضاي فوقاني انجام گيرد. در اين روش‌ها گونه‌هاي خارج شده از بافت نمونه، ابتدا به فضاي فوقاني نمونه وارد و سپس توسط يك فاز استخراجي جذب و تغليظ مي‌شوند. در نهايت گونه‌ها به دستگاه اندازه‌گيري تزريق مي‌شوند. تغليظ انجام شده باعث دستيابي به حساسيت‌هاي بالا شده و اندازه‌گيري مقادير بسيار كم گونه‌هاي مختلف را امكان‌پذير مي‌سازد.
روش‌هاي ميكرواستخراج از فضاي فوقاني به كار رفته تا كنون بر مبناي دو روش فاز جامد و قطره بوده‌اند. در روش ميكرواستخراج با فاز جامد از فضاي فوقاني، نمونه حاوي گونه‌هاي مختلف در ظرف در بسته‌اي قرار داده مي‌شود و از فيبري با پوشش‌ها و جاذب‌هاي مختلف براي استخراج و تغليظ نمونه استفاده مي‌شود. پس از گذشت مدت زمان لازم و به تعادل رسيدن سيستم، فيبر جاذب به منظور آناليز به دستگاه‌هاي اندازه‌گيري معرفي مي‌گردد. اين روش داراي معايبي چون، قيمت نسبتاً بالاي فيبرهاي فاز جامد، محدوديت در انواع پوشش فيبرها، محدود بودن طول عمر فيبرها و اثرات حافظه مي‌باشد ]4[.
اما در روش ميكرواستخراج با قطره، چند ميكروليتر از يك حلال آلي از انتهاي سوزن يك ميكروسرنگ در فضاي فوقاني يك ظرف در بسته حاوي محلول نمونه در حال هم‌زدن به طور معلق نگهداشته مي‌شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص و انتقال مقداري از آناليت‌ها به فاز آلي، حلال به داخل سرنگ كشيده شده و به سيستم اندازه‌گيري تزريق مي‌شود. اين تكنيك، ساده، سريع، ارزان و بسيار حساس است و تنها با استفاده از يك ميكروسرنگ، مراحل مختلف استخراج، تغليظ و تزريق به سيستم اندازه‌گيري قابل انجام است. علاوه بر اين به دليل عدم تماس مستقيم حلال استخراج كننده با بافت نمونه، مزاحمت‌هاي ناشي از آلودگي حلال استخراج كننده توسط بافت نمونه رفع شده است. از طرفي در اين روش مي‌توان از حلال‌هاي استخراج كننده قابل امتزاج با آب نيز استفاده كرد. از محدوديت‌هاي اين روش تبخير حلال استخراج كننده با گذر زمان مي‌باشد كه مانع از افزايش زمان و استخراج و همچنين دماي محلول مي‌شود
كه اين مشكل را مي‌توان با سرد كردن سوزن ميكروسرنگ كه منجر به سرد شدن ميكرو قطره مي‌شود تا حدودي رفع كرد. البته اين روش داراي مشكلاتي نظير عدم استفاده از حجم‌هاي بيشتر قطره به دليل افتادن قطره و مساحت سطح كوچك قطره مي‌باشد كه منجر به كاهش كارايي استخراج مي‌گردد. به دنبال تحقيقات صورت گرفته روي HF-LPME كه همگي براساس استخراج مستقيم از محلول نمونه مي‌باشد. Jiang يك روش جديد از آناليز فضاي فوقاني بر مبناي HF-LPME را معرفي كردند. اين تكنيك مشابه با روش استفاده شده در HF-LPME مي‌باشد، با اين تفاوت كه فيبر توخالي در فضاي فوقاني محلول نمونه قرار مي‌گيرد. بدين ترتيب مزاحمت‌هاي ناشي از بافت پيچيده نمونه برطرف مي‌شود. از طرفي به دليل اينكه فاز استخراجي درون فيبر توخالي قرار گرفته، مشكل افتادن حلال استخراجي در اينجا رفع شده است و مي‌توان از حجم‌هاي بيشتر نيز استفاده نمود. علاوه بر اين دليل افزايش مساحت سطح تماس حلال استخراجي و فضاي فوقاني، استخراج‌ها سريع‌تر و با كارايي بيشتري قابل انجام است. همچنين به دليل ارزان بودن فيبر توخالي، مي‌توان از هر فيبر يك بار براي استخراج استفاده نمود. بنابراين مشكلات اثرات حافظه، موجود در روش فاز جامد، در اين روش وجود نخواهد داشت. از محدوديت اين روش مي‌توان به تبخير و از دست رفتن حلال استخراجي طي فرايند استخراج اشاره كرد، كه اين مشكل نيز با سرد كردن حلال استخراجي قابل رفع است. شماتيك ميكرواستخراج فاز مايع فيبر توخالي به دو روش مستقيم و فضاي فوقاني در شكل (2-7) نشان داده شده است.
شكل (2-7). طرح شماتيك ميكرواستخراج فاز مايع به روش (الف) مستقيم و (ب) فضاي فوقاني

سيستم ميكرواستخراج از فضاي فوقاني به دو شيوه استاتيك و ديناميك قابل انجام است. در روش ديناميك حلال آلي داخل فيبر توخالي توسط پمپي كه به پيستون ميكروسرنگ متصل شده است، به طور پي در پي داخل فيبر توخالي پر و خالي مي‌شود ]82[. به اين ترتيب حجم معيني از فضاي فوقاني با سرعت مشخص و ثابت به داخل فيبر توخالي كشيده مي‌شود و پس از چند ثانيه توقف، دوباره فاز گازي با فشرده شدن پيستون ميكروسرنگ خارج شده و اين عمل به دفعات معين تكرار مي‌شود. پس از كشيدن حلال به داخل ميكروسرنگ، سوزن ميكروسرنگ از فيبر توخالي خارج شده و به دستگاه آناليز تزريق مي‌شود. مكانيسم عمل به اين صورت است كه هنگام بالا كشيدن پيستون ميكروسرنگ، لايه‌اي از حلال كه داخل منافذ فيبر توخالي است، سطح زيادي را در معرض فاز فوقاني مربوط به فضاي فوقاني محلول نمونه كه به داخل فيبر توخالي كشيده مي‌شود، قرار مي‌دهد. آناليت‌هاي موجود در اين فاز گازي به داخل حلال آلي استخراج مي‌شوند و با كشيدن و فشردن پيستون، هر بار اين فاز گازي تجديد مي‌شود. از طرفي بالا كشيدن حلال آلي به داخل سرنگ، باعث هم‌زدن و يكنواختي حلال آلي مي‌شود و هنگامي كه حلال دوباره با فشار پيستون به داخل فيبر تو خالي بر مي‌گردد، مثل اين است كه در معرض حلال جديدي قرار گرفته است. زيرا گونه‌‌هاي جذب شده در سطح حلال آلي در طي اين فرآيند به داخل توده حلال استخراجي مي‌روند و غلظت گونه‌ها در حلال استخراجي يكنواخت مي‌شود. اين عمل بارها انجام مي‌شود تا غلظت مناسبي از گونه‌ها در فاز آلي تجمع و تغليظ گردد. در اين روش كوچك بودن فضاي درون فيبر توخالي و تعادل سريع بين آناليت‌ها در فاز آلي و آبي باعث كاهش ميزان تبخير حلال آلي مي‌شود. سيستم ديناميك نسبت به حالت استاتيك داراي حساسيت بيشتري است، اما به دليل عدم تكرارپذيري در كشيدن و فشار دادن پيستون ميكروسرنگ، تكرارپذيري روش ديناميك به خوبي استاتيك نيست. البته اخيراً با اتوماسيون سيستم كشيدن و فشار دادن پيستون توسط پمپ‌هاي مناسب، اين مشكل تا حدود زيادي رفع گرديده است.
2-1-1-3. ميكرواستخراج فاز مايع با استفاده از انجماد حلال استخراج كننده


پاسخ دهید