?-?-? رده سلولي موردمطالعه30
?-?-? آماده‌سازي محيط کشت سلولي30
?-?-? پاساژ سلولي31
?-?-? شمارش سلولي32
?-?-? انجماد و ذخيره‌سازي سلول‌ها33
?-?-? ذوب کردن سلول‌هاي منجمد شده33
?-?-? تهيه فرآورده عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف34
?-? بررسي اثر عصاره پلاکتي بر تکثير (فيبروبلاست)35
?-? بررسي اثر فرآورده عصاره پلاکتي بر درصد بقاء سلول‌هاي فيبروبلاست36
?-? اندازه‌گيري ميزان مهاجرت سلولي به روش assay Scratch36
?-? فرمول بکار رفته در تست خراشيدگي37
?-? بررسي بيان ژن37
?-?-? مراحل استخراج RNA38
?-?-? تيمار RNA با DNAase?40
?-?-? تعيين جذب نوري و غلظت نمونه‌هاي RNA40
?-?-? الکتروفورز، رنگ‌آميزي و مشاهده RNA بر روي ژل آگارز40
?-?-? سنتز cDNA42
?-?-? واکنش زنجيره‌اي پليمراز 43
?-?-7 پرايمر43
?-?-8 نحوه رقيق کردن پرايمر43
?-?-9 Real time PCR44
?-? جمع‌آوري عصاره سلولي46
?-?-? تعيين غلظت پروتئين‌ها به روش بردفورد46
?-?-? انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسي تغييرات سطح پروتئين‌هاي psmad2/3, smad2/3 در مسير smad signaling47
?-?-? مرحله الکتروفوز48
?-?-? مرحله ساندويچ48
?-?-? مرحله Blocking و افزودن آنتي‌بادي‌ها:49
?-?-? مرحله Stripping50
?-?-? مرحله ظهور فيلم51
?-? آناليزهاي آماري51
فصل سوم نتايج53
?-? بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف بر تکثير سلول‌هاي فيبروبلاست54
?-? بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌هاي فيبروبلاست56
?-? نتايج حاصل از بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌هاي فيبروبلاست57
?-? نتايج حاصل از بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف لايزت پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف‌بر بيان ژن‌هاي Smad2 و Smad3 درسلول هاي فيبروبلاست تيمار شده62
?-?-? کيفيت RNA استخراج‌شده62
?-? بررسي ميزان بيان پروتئين‌هاي Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات68
فصل چهارم بحث72
4-1 بحث73
4-2 نتيجه گيري79
?-3 پيشنهاد‌ها80
منابع81
منابع انگليسي82
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1- 1: ليست کامل از فاکتورهاي رشد در پلاکت (22)9
جدول 1- 2: ليستي از محتويات ? گرانول‌هاي پلاکتي (??)11
جدول 2- 1: تجهيزات مورداستفاده28
جدول 2- 2: مواد مصرفي جهت آزمايشات سلولي29
جدول 2- 3: مواد و وسايل موردنياز براي بررسي بيان ژن29
جدول 2- 4: مواد و وسايل موردنياز براي تکنيک وسترن بلات30
جدول 2- 5: توالي پرايمر43
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرايند ترميم زخم (??)5
شکل1- 2: مرحله شکل گيري بافت در فرايند ترميم زخم (14)6
شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ايجاد لخته پلاکتي (22)10
شکل 1- 4: ارتباط مسير سيگنالينگ smad2/3 با فرايند ترميم زخم26
شکل 2- 1: کشت سلول در پليت ? خانه36
شکل 2- 2: نحوه کشيدن خراش در تکنيک assay Scratch37
شکل 2- 3: ? فاز تشکيل‌شده در استخراج RNA38
شکل 2- 4: نماي کلي از استخراج RNA39
شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روي ژل اگاروز41
شکل 2- 6: ساختار شيميايي سايبر گرين44
شکل 2- 7: مکانيسم عمل سايبر گرين45
شکل 2- 8: مرحله تهيه ساندويچ49
شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتي‌بادي‌ها50
شکل 3- 1: بررسي افزايش تکثير در غلظت‌هاي متفاوت عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف در مقايسه با گروه‌هاي کنترل در ?? ساعت55
شکل 3- 2: تأثير غلظت‌هاي متفاوت UCB-PL بر تکثير فيبروبلاست. در اين شکل علامت* به معني تفاوت معني‌دار گروه ??% در مقايسه با گروه‌هاي ديگر است. (p<????55
شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثير غلظت‌هاي متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فيبروبلاست در اين شکل علامت* به معني تفاوت معني‌دار گروه با غلظت ??% در مقايسه با همه گروه‌هاي ديگر به‌جز گروه POS و ??%-?% است.57
شکل 3- 4: نمودار مربوط به تأثير غلظت‌هاي متفاوت UCB-PL بر مهاجرت فيبروبلاست.a) p<????58

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ?% بر ميزان مهاجرت سلولي در سلول‌هاي فيبروبلاست به روش scratching در ? زمان ?-?-??-?? ساعت بعد از خراش58
شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ??% بر ميزان مهاجرت سلولي در سلول‌هاي فيبروبلاست به روش scratching در ? زمان ?-?-??-?? ساعت بعد از خراش59
شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر ميزان مهاجرت سلولي در سلول‌هاي فيبروبلاست به روش scratching در ? زمان ?-?-??-?? ساعت بعد از خراش60
شکل 3- 8: سنجش اثر FBS??% بر ميزان مهاجرت سلولي در سلول‌هاي فيبروبلاست به روش scratching در ? زمان ?-?-??-?? ساعت بعد از خراش61
شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفي بر ميزان مهاجرت سلولي در سلول‌هاي فيبروبلاست به روش scratching در ? زمان ?-?-??-?? ساعت بعد از خراش62
شکل 3- 10: کيفيت RNA استخراج‌شده در گروه‌هاي مختلف63
شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فيبروبلاست هاي تيمار شده با دزهاي مختلف از UCB-PL و بررسي بيان ژن GAPDH64
شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فيبروبلاست هاي تيمار شده با دزهاي مختلف از UCB-PL و بررسي بيان ژن GAPDH64
شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فيبروبلاست هاي تيمار شده با غلظت‌هاي مختلف از UCB-PL و بررسي بيان ژن smad?65
شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فيبروبلاست هاي تيمار شده با غلظت‌هاي مختلف از UCB-PL و بررسي بيان ژن smad265
شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فيبروبلاست هاي تيمار شده با غلظت‌هاي مختلف از UCB-PL و بررسي بيان ژن smad266
شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فيبروبلاست هاي تيمار شده با دزهاي مختلف از UCB-PL و بررسي بيان ژن smad366
شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهاي مختلف UCB-PL بر ميزان بيان Smad2 در سلول‌هاي فيبروبلاست تيمار شده به روش Real time-PCR67
شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهاي مختلف UCB-PL بر ميزان بيان Smad3 در سلول‌هاي فيبروبلاست تيمار شده به روش Real time-PCR68
شکل 3- 19: رنگ‌آميزي ژل حاوي پروتئين‌ها69
شکل 3- 20: وسترن بلات براي پروتئين Smad270
شکل 3- 21: وسترن بلات براي پروتئين P Smad270
شکل 3- 22: وسترن بلات براي پروتئين Smad370
شکل 3- 23: وسترن بلات براي پروتئين p-Smad371
مقدمه
فرآورده عصاره پلاکتي1 PL مشتق از خون‌بند ناف محصولي هست که از فرآورده پلاسماي غني از پلاکتي PRP به دست مي‌آيد.. اين ماده به علت غني بودن از مواد مفيد زيستي در ترميم زخم‌ مورداستفاده قرار مي‌گيرد. به دليل اينکه PL داراي انواع فاکتورهاي رشد است و قادر به شروع مسير سيگنالينگ Smad مي‌شود. در اين مطالعه اثر عصاره پلاکتي بر تکثير و مهاجرت و درصد بقاء سلول‌هاي فيبروبلاست در شرايط آزمايشگاهي موردبررسي قرار گرفت.
سلول‌هاي فيبروبلاست در محيط کشت DMEM حاوي غلظت‌هاي ?%، ?%، ??%، ??% و ??% از عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف همراه با گروه کنترل مثبت که حاوي FBS 10% و کنترل منفي که خالي از هر ? (FBS و UCB-PL) بود، کشت شدند و همچنين از گروه (UCB-PL/FBS) که به نسبت مساوي از عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف و FBS استفاده شد. تعيين مقدار مناسب و مؤثر بر تکثير و درصد بقاء سلولي توسط شمارش سلولي با تريپان‌بلو در زمان‌هاي متفاوت ??، ?? و ?? ساعت بررسي شد. هم‌چنين براي تعيين مقدار مناسب براي مهاجرت سلولي از تکنيک Scarch assay استفاده شد. سپس اثر عصاره پلاکتي با غلظت‌هاي متفاوت بر بيان ژن‌هاي smad2-smad3 در سلول‌هاي فيبروبلاست توسط تست Real Time -PCR موردبررسي قرار گرفت. در مرحله آخر جهت بررسي اثر عصارهي پلاکتي بر مسير سيگنالينگ Smad، مقدار بيان پروتئين‌هاي Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3توسط تکنيک وسترن بلات ارزيابي شد.
نتايج:
در بررسي تکثير و درصد بقاء و مهاجرت سلول‌هاي فيبروبلاست در اثر تيمار با عصاره پلاکتي بالاترين غلظت مؤثر مربوط به دز ??% نشان داده شد و نتايج حاصل از اين مطالعه نشان داد که افزايش غلظت عصاره پلاکتي، اثر افزايشي بر تکثير و درصد بقاء سلول‌هاي فيبروبلاست ندارد. همچنين عصاره پلاکتي در دز ??% سبب افزايش سرعت مهاجرت سلول‌هاي فيبروبلاست مي‌شود. در نتايج حاصل از تکنيک Real time اثر عصاره پلاکتي در غلظت ??% با افزايش بيان ژن‌هاي
Smad2-Smad3 نسبت به گروه‌هاي کنترل منفي و مثبت با تفاوت معناداري نشان داده شد. در بررسي‌هاي صورت گرفته در سنجش اثر عصاره پلاکتي در غلظت‌هاي مختلف ?%، ??% و گروه UCB-PL/FBS و گروه کنترل مثبت و منفي بر بيان پروتئين‌هاي Smad2-Smad3-Psmad2-Psmad3 به‌واسطه تکنيک وسترن بلات نشان داد که تمامي گروه‌ها تفاوت معناداري نسبت به گروه کنترل منفي دارند. پروتئين‌هاي Psmad2-Psmad3 که پروتئين‌هاي فرم فعال‌شده Smad2-Smad3 هستند تنها در گروه کنترل منفي ديده نشدند بلکه در تمامي گروه‌هايي که داري عصاره پلاکتي بودند اين پروتئين‌ها فعال شدند.
نتيجه‌گيري
يکي از مهم‌ترين سلول‌هاي دخيل در امر ترميم زخم، فيبروبلاستها مي‌باشند، که با تکثير و مهاجرت سلولي و به راه انداختن مسيرهاي سيگنالينگ درون‌سلولي مربوط به ترميم زخم در پيشبرد فرايند ترميم نقش کليدي بر عهده‌دارند. در اين مطالعه با نشان دادن اثر عصاره پلاکتي بر اعمال مهم و ضروري سلول‌هاي فيبروبلاست در فرايند ترميم زخم مي‌توان نتيجه گرفت که فرآورده عصاره پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف مي‌تواند نقش بسزايي در افزايش ترميم زخم‌ها داشته باشد.
فصل اول
کليات
1-1 تعريف زخم و انواع آن
ايجاد هرگونه شکاف و از بين رفتن پيوستگي بافت‌هاي بدن چه در داخل و چه در سطح خارجي بدن را زخم مي‌نامند. به‌عبارت ‌ديگر هرگونه صدمه به نسج نرم را زخم گويند. نسج نرم در بدن شامل: پوست، عضلات عروق خوني و اعصاب است.(?) پوست از ? لايه اپيدرم،درم وزير پوست تشکيل‌شده اسـت. مـاتريکس خـارج سـلولي2 بزرگ‌ترين جـزء تشکيل‌دهند? پوست طبيعي است که ژل‌مانند است و به‌وسيله‌ي سلول‌هاي پوست توليد مي‌شود. حفظ ساختار طبيعي پوست به‌خصوص پوست صورت ، بسيار مهم است. چراکه ظاهر و جلوه مناسب ارزش بـالايي در روابط اجتماعي فرد دارد .(?) پوست اولين و مهم‌ترين سد دفاعي بدن است. بنابراين لازم است هرگونه صدمه‌اي که به اين ارگان مي‌رسد در کوتاه‌ترين زمان ممکن برطرف شود. فرايند ترميم زخم يکي از عملکردهاي طبيعي بدن است، اما در شرايطي مانند برخي بيماري‌ها، جراحي‌ها و صدمات وسيع ناشي از سوختگي‌ها و تصادفات، بدن به‌راحتي قادر به ترميم زخم نيست. که اين موضوع به‌عنوان يک مشکل شناخته‌شده در پزشکي مدرن امروز به شمار مي‌آيد.(?)
?-? سوختگي
سوختگي يکي از انواع زخم‌ها است که همه‌روزه به اشکال مختلف انسان‌ها را تهديد مي‌کند و بيش از ?? درصد سوختگي‌ها در کشورهاي درحال‌توسعه و توسعه‌ نيافته اتفاق مي‌افتد. ششمين علت مرگ در کشور ما محسوب مي‌شود.(?)
?-? زخم بستر
زخم بستر يکي از عوارض بستري شدن در بيمارستان‌ها است. سالانه ??????? نفر در مراکز درماني ايالات‌متحده دچار زخم بستر مي‌شوند. ميزان بروز اين عارضه در بيماران بستري‌شده در بيمارستان‌ها معمولاً ?? درصد است. افزايش عوامل خطرزا و بي‌حرکتي در بيماران بخش مراقبت‌هاي ويژه باعث افزايش احتمال تشکيل زخم بستر مي‌گردد. به‌طوري‌که در آمريکا ?? درصد از بيماران بستري در بخش مراقبت‌هاي ويژه دچار زخم بستر مي‌شوند. در کشور ايران برآورد شده است ? درصد بيماران بستري‌شده در بيمارستان‌ها و ?? درصد مددجويان نقاهتگاه‌ها مبتلابه زخم بستر هستند. در مواردي از زخم‌ها از قبيل زخم بستر، سوختگي و جراحت‌ها استفاده از روش‌هاي پيشرفته امکان بررسي، مطالعه و درمان ترميم بافت را فراهم نموده است. (?)
?-? ترميم زخم
فرآيند ترميم زخم از يکسري وقايع پيچيده سلولي و مولکولي تشکيل‌شده است که اين فرايندها نياز به مشارکت هماهنگ از انواع سلول‌هاي مختلف ازجمله کراتينوسايت3، فيبروبلاست، پلاکت، اندوتليالها و سلول‌هاي التهابي مي‌باشند.(?)
يکسري مولکول‌هاي واسطه‌گر محلول و همچنين پروتئازها و پروتئين‌هاي چسبنده باعث مهاجرت سلول‌ها به ناحيه زخم مي‌شوند.(?)
تشکيل بافت جديد از مهاجرت سلول‌هاي کراتينوسايت به ناحيه اپيدرم صدمه‌ديده شده شروع مي‌شود و به دنبال آن با تکثير سلول‌هاي فيبروبلاست به لبه‌هاي زخم ادامه ميابد. اين فرايند
Re Epithelisation نام دارد که خود باعث ايجاد يک پوشش سريع براي زخم محسوب مي‌شود به ‌موازات تعمير اپيدرم ترميم درم آسيب‌ديده نيز با مهاجرت و تکثير سلول‌هاي فيبروبلاست که توليد مقدار زيادي ماتريکس4 خارج سلولي مي‌کنند شروع مي‌شود.(?) فرايند ترميم زخم در واقع شامل مجموعهايي از تعاملات ميان سلول‌هاي اپيدرمي و سلول‌هاي درم پوست، ماتريکس خارج سلولي و پروتئين‌هاي پلاسما است. اين فرايند پويا به سه فاز تقسيم مي‌شود: التهاب- شکلگيري بافت-بلوغ و بازسازي بافت. اين مراحل با همديگر تداخل دارند.(?)
?-? التهاب
در چند دقيقه پس از آسيب‌ديدگي، پلاکت‌ها در محل جراحت جمع شده و يک لخته فيبريني ايجاد مي‌کنند که باعث کاهش خونريزي مي‌شود. سرعت بهبود زخم به سطح جريان خون از پلاکت‌ها و فيبرين و هورمون‌ها بستگي دارد. همچنين پلاکت‌ها علاوه بر ايجاد لخته فيبريني باعث تسهيل تشکيل هموستئاز نيز مي‌شوند.(??) در مرحله التهاب يکسري از گلبول‌هاي سفيد خون با عمل فاگوسيتوز خودشان باکتري‌ها ولاشه‌هاي سلولي ناحيه زخم را پاک‌سازي مي‌کنند.(??) فاکتورهاي رشد آزادشده از سلول‌ها به ناحيه زخم باعث مهاجرت و تقسيم سلولي در اين مرحله مي‌شوند.(??)
در اين مرحله پلاکت‌ها همچنين چندين واسطه‌گر براي ترميم زخم ازجمله مشتقات پلاکتي و فاکتورهاي رشد را ترشح مي‌کنند که ماکروفاژها و فيبروبلاست‌ها را جذب و فعال مي‌کنند.(??)
مونوسيت‌ها نيز به محل زخم نفوذ پيدا کرده‌اند و تبديل به ماکروفاژ مي‌شوند. با رهاسازي فاکتورهاي رشد مشتق از پلاکت5 و فاکتورهاي رشد اندوتليال عروقي6 باعث تشکيل بافت گرانوله مي‌شوند. ماکروفاژ با اتصال به پروتئين‌هاي ماتريکس خارج سلولي به‌وسيله رسپتورهاي اينتگريني7 باعث تحريک فعاليت فاگوسيتوزي خودشان مي‌شوند.(??)
مونوسيت‌ها وماکروفاژها در اين مرحله باعث بيان يکسري سايتوکاين‌هاي مهم نظير
TGF a-TGFb: اينترلوکين18 و فاکتور رشد شبه انسولين مي‌شوند. مونوسيت‌ها و ماکروفاژها عوامل مشتق شده از آن‌ها به‌طورقطع براي شروع و انتشار تشکيل بافت جديد ضروري هستند.(??) بنابراين ماکروفاژها نقش مهمي در انتقال فاز بين مراحل التهاب و تعمير بافت دارند. (??)

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرايند ترميم زخم (??)
?-? شکل‌گيري بافت
اپيتليوم9سازي در عرض چند ساعت پس از ايجاد آسيب به پوست ايجاد مي‌شود که در منطقه اپيدرم پوست رخ مي‌دهد و به‌موجب آن سلول‌هاي اپي تليالي تکثير پيداکرده و به‌صورت خزيدن يا اصطلاحاً (سينه‌مال رفتن) به بالاي منطقه زخم مهاجرت مي‌کنند و پوششي براي بافت جديد مي‌سازند. فاکتورهاي خون به منطقه زخم آزاد مي‌شوند و مهاجرت و تکثير سلولي را در اين مرحله بيشتر مي‌کنند. اين مرحله شامل رگ زايي، رسوب کلاژن، تشکيل بافت گرانولاسيون، اپيتلاسيون و انقباض منطقه زخم است.(??) يکي از مهم‌ترين فرايند اين مرحله مهاجرت سلولي است که با انحلال دسموزوم‌هاي درون‌سلولي ارتباط فيزيکي سلولي بيشتر شده و همچنين تشکيل رشته‌هاي محيطي اکتين سيتوپلاسمي مهاجرت سلولي را تسهيل مي‌کند.(??) در ? تا ? روز پس از آسيب‌ديدگي سلول‌هاي اپيدرمي در حاشيه زخم به‌طور فعال به مهاجرت و تکثير سلولي مي‌پردازند.(??), (??)
شکل1- 2: مرحله شکل گيري بافت در فرايند ترميم زخم (14)
?-? بلوغ و بازسازي بافت
مرحله بلوغ بازسازي بافت زماني که سطح توليد و تخريب کلاژن يکسان شود شروع مي‌شود.(??) در طي مرحله بلوغ کلاژن تيپ ? در تکثير سلولي با کلاژن تيپ ? جايگزين مي‌شود.رشته کلاژن در ابتدا به‌صورت نامرتب در کنار هم قرار مي‌گيرند با پيشرفت مرحله بازسازي در امتداد هم خطوط مرتبي را تشکيل مي‌دهند.(??) شروع اين مرحله و گستردگي‌اش به وسعت اندازه منطقه زخم بستگي دارد.(??)
?-? روش‌هاي درماني براي تسريع و بهبود فرايند ترميم زخم
در ضايعات پوستي معمولاً بدن خود به‌سرعت شروع به التيام زخم مي‌کند. اما برخي از زخم‌ها به‌طور کامل ترميم نمي‌يابند. و يا ازلحاظ زيبايي و عملکرد به‌خوبي بهبود پيدا نمي‌کنند. اين زخم‌ها به‌عنوان چالش قابل‌توجهي در خدمات بهداشت عمومي و همچنين به‌عنوان درمان‌هايي که معمولاً قابل‌درمان نيستند و باعث مختل کردن کيفيت زندگي بيمار مي‌شوند به شمار مي‌آيند. (?)
از اين ‌رو نسل جديد درمان با ارائه شتاب در درمان و کاهش عوارض مرتبط با زخم است. به‌طور مثال مطالعات باليني نشان داده است که زخم‌هاي مزمن به علت در دسترس نداشتن عوامل رشد و به راه انداختن آبشارهاي درون ‌سلولي قادر به ترميم نيستند. بنابراين استفاده از اين عوامل رشد به ترميم سريع بافت کمک مي‌کند. مطالعات انجام‌شده در بازگرداندن يکپارچگي بافت تأکيد کرده‌اند که پلاکت‌ها در روند ترميم زخم نقش بسزايي دارند. پانسمان موضعي با مشتقات پلاکتي با موفقيت مورد استفاده قرار گرفته است، و به‌عنوان يک روش درماني براي سرعت بخشيدن به بازسازي بافت به شمار مي‌رود.(??, ??)
?-? پلاکت10 و نقش آن درروند ترميمي زخم
اثرات سودمند پلاکت و مشتقات پلاکتي به علت محتواي بالايي از فاکتورهاي رشد و سيتوکين11‌هايي است که توسط پلاکت‌هاي فعال‌شده در انعقاد خون آزاد مي‌شوند. پلاکت‌ها اجسام کوچک کروي دانه‌داري با قطر ?-? ميکرون مي‌باشند. که ديواره آن‌ها چسبنده بوده و به‌سادگي به پلاکت‌هاي ديگر و اجسام خارجي مي‌چسبد. غشاي پلاکت‌ها شکننده بوده و در تماس با ذرات خارجي و يا ضربه متلاشي مي‌گردد. عمر پلاکت‌ها ?-?? روز و تعداد آن‌ها در هر ميلي‌متر مکعب ??????-??????? است.
?-?? ساختمان و عملکرد پلاکت‌ها
پلاکت‌ها در موارد زير مداخله مي‌کنند:
?) در بريدگي‌ها با آزاد کردن سروتونين باعث تنگي رگ مي‌گردند.
?) با آزاد کردن عوامل انعقادي موجب پيشبرد انعقاد مي‌گردند از اين‌ رو ترومبوسيت نيز ناميده مي‌شوند.
?) موجب انقباض لخته مي‌گردند.
?) به عوامل خارجي چسبيده و آن‌ها را فاگوسيتوز مي‌کنند.
?) نقش ديگر پلاکت‌ها حفاظت از سلامت و يکنواختي ساختمان ديواره عروق است.
?) پلاکت‌ها به‌عنوان عوامل پرورش‌دهنده سلول‌هاي اندوتليال ديواره عروق داراي نقش هستند.
بدين‌صورت که با چسبيدن يک پلاکت به سلول اندوتليال مقدار سيتوپلاسم موجود بين اين دو کاهش‌يافته و حتي ممکن است يک پلاکت جزئي از سلول اندوتليال گردد. وجود اين حالت همراه با آزاد شدن عامل رشد اندوتليال به‌وسيله پلاکت داراي يک اثر پرورش‌دهنده يا تغذيه‌اي براي سلول اندوتليال است.
با آزاد شدن فاکتور رشد مشتق پلاکتي که يک عامل ايجاد ميتوز است، کيفيت ديواره عروق بهبود مي‌يابد. در غياب پلاکت‌ها تعداد زيادي گلبول قرمز به داخل ديواره رگ‌ها مهاجرت کرده، به مسيرهاي لنفاوي راه مي‌يابند. در ديواره عروق خوني سالم تغذيه سلول‌هاي اندوتليال رگ‌هاي خوني بر عهده پلاکت‌ها است حضور حداقل ?? درصد پلاکت‌ها در رگ‌هاي در حال جريان خون ضروري است.(??)
غشا خارجي پلاکت‌ها توسط يک‌لايه گليکوکاليکس در برگرفته‌ شده است. غشا خارجي داراي کانال‌هاي فراواني است که از طريق آن‌ها در هنگام فعال شدن، يون‌هاي کلسيم از مايعات خارج سلولي وارد شده و از طرف ديگر محتواي گرانول‌ها از پلاکت‌ها ترشح مي‌گردد.
فعال شدن پلاکت و آزاد شدن محتويات گرانول‌هاي آن احتياج به انرژي دارد که به‌وسيله ??-?? ميتوکندري12 در هر پلاکت تأمين مي‌شود. هر پلاکت مملو از فاکتورهاي رشد هستند. که ليست کاملي از فاکتورهاي رشد پلاکتي در جدول (?-?) آورده شده است.
جدول 1- 1: ليست کامل از فاکتورهاي رشد در پلاکت (22)
مواجه‌شدن پلاکت‌ها با يک عامل فعال‌کننده موجب بروز تغييراتي در شکل و خواص آن‌ها مي‌گردد، شکل صفحه مانند سريعاً به کروي شکل تغيير کرده و از سطوح خارجي آن‌ها تعدادي استطاله‌هاي مو مانند طويل بنام filiopodia خارج مي‌شود و پلاکت‌ها آزاد کردن عناصر موجود در گرانول‌ها را شروع کرده و در حين فعال شدن شروع به چسبيدن به يکديگر Aggregation مي‌نمايند و به‌طور همزمان ساير مواد فعال‌کننده پلاکت‌ها را آزاد مي‌کنند و در نتيجه رفته ‌رفته برنجم پلاکت‌هاي به هم چسبيده در محل صدمه ‌ديده بافت افزوده مي‌شود و احتمالا حجم پلاکتي به‌عنوان چوب‌پنبه به‌قدر کافي جهت پر کردن محل بريده‌شده رگ خواهد. بديهي است چوب‌پنبه پلاکتي براي جلوگيري از خونريزي رگ‌هاي با قطر زياد کارا نخواهد بود. چگونگي اتصالات دو پلاکت در ايجاد لخته پلاکتي در شکل (?-?) آورده شده است. پس از چند ساعت پلاکت‌هاي موجود در چوب‌پنبه با هم آميخته ‌شده و هويت خود را از دست‌ داده و به‌صورت يک ژل هموژن تقريباً غيرقابل تشخيص از لخته فيبرين در مي‌آيند. (??)
شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ايجاد لخته پلاکتي (22)
جدول 1- 2: ليستي از محتويات ? گرانول‌هاي پلاکتي (??)
?-?? مزاياي استفاده از خون‌بند ناف
همانند خون محيطي، خون‌بند ناف نيز حاوي پلاکت است که مي‌توان با استفاده از سانتريفوژ آن‌ها را مي‌توان از نظر پلاکت غني نمود. ازآنجايي‌که پلاکت‌هاي خون‌بند ناف حساسيت کمتري ايجاد مي‌کنند لذا مي‌توان اين محصول را به‌صورت غيرخودي نيز به‌خصوص در موارد اورژانس مورد استفاده قرار داد. ازآنجايي‌که امکان ذخيره اين محصول نيز وجود دارد لذا مي‌توان آن را به شکل عاري از گلبول سفيد و يا عصاره پلاکتي هم مورد استفاده قرارداد که اثرات ضد التهابي و ترميمي بيشتري دارد. ضمن آن‌که در بيماراني که به دليل از دست دادن خون و يا بيماران دچار سوختگي امکان گرفتن خون و پلاسما به مقدار زياد وجود ندارد اين محصول مي‌تواند بسيار مؤثر و کارآمد باشد.
?-?? مزيت فرآورده‌هاي پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف نسبت به خون محيطي
مطالعه‌ايي که اخيراً صورت گرفته نشان داده که مقادير فاکتورهاي رشد ژل پلاکتي مشتق از خون بند ناف نسبت به خون محيطي متفاوت است. در اين مطالعه نشان داده‌شده است که بالاترين سطح فاکتورهاي رشد مربوط به فاکتور رشد اندوتليال عروقي و فاکتور رشد مشتق از پلاکت است که هر دو اين فاکتورها دو فاکتور مهم و کليدي براي پروسه ترميم زخم است، اما فاکتور رشد فيبروبلاست13 و فاکتور رشد کبدي14 و فاکتور رشد تبديل بتا 115 نيز مقادير قابل‌توجهي داشته‌اند. اين يافته‌ها نشان مي‌دهند که ژل پلاکتي مشتق از خون‌بند ناف از نظر فاکتورهاي رشد با ژل پلاکتي مشتق از خون محيطي متفاوت است.(??)،(??)
?-?? انواع محصولات مشتق از پلاکت
?-?? پلاسماي غني از پلاکت16
پلاسماي غني از پلاکت محصولي است که ميزان پلاکت در آن به ميزان ? تا ? برابر تغليظ شده است. اين فرآورده حاوي مقادير بالايي از فاکتورهاي رشد وسيتوکين‌ها است. براي تهيه پلاسماي غني از پلاکت بعد از گرفتن خون با استفاده از يک ضد انعقاد، نمونه خون‌گرفته شده سانتريفوژ مي‌شود تا بر اساس جرم حجمي اجزا خون سه لايه جدا تشکيل شود.
لايه زرد رنگ همان پلاسما است که عاري از هر نوع سلولي است، قسمت قرمز رنگ که در ته لوله قرار مي‌گيرد، گلبول‌هاي قرمز خون است و لايه سه که يک‌لايه سفيد رنگ مابين پلاسما و گلبول‌هاي قرمز است و با نام بافي‌کوت شناخته مي‌شود، حاوي گلبول‌هاي سفيد بوده و پلاکت‌هاي خون در اطراف آن قرار گرفته‌اند. بعد از جداسازي اين بخش، محلول به‌دست‌آمده به‌گونه‌اي تغليظ مي‌شود که حداقل ? تا ? برابر خون پلاکت داشته باشد (??)
?-?? ژل پلاکتي17
براي استفاده از PRP بايد اين محصول به‌صورت ژل پلاکتي يا عصاره پلاکتي تبديل شود. در تهيه ژل پلاکتي فرآورده پلاسماي غني از پلاکت قبل از استفاده توسط ترومبين و يا کلسيم فعال مي‌گردد. پلاکت‌هاي به دام افتاده در ژل پلاکتي فعال مي‌شوند و مولکول‌هاي فعال زيستي خودشان را به‌آرامي در محيط اطراف پخش مي‌کنند. اثر ژل پلاکتي مشتق از خون محيطي در مطالعات invitro و invivo ارزيابي ‌شده است.(??)
به‌منظور تکثير و تمايز سلول‌هاي مزانشيمي، از FBS به‌عنوان يک مکمل در محيط کشت استفاده مي‌شود که با خطر انتقال انواع عفونت‌ها و ايجاد واکنش‌هاي ايمني همراه است. ژل پلاکتي اتولوگ، از اجزاي طبيعي خون خود فرد تهيه مي‌شود. پلاکت‌هاي فعال‌شده، عوامل رشدي را آزاد مي‌سازند که خاصيت ميتوژنيک براي سلول‌هاي مزانشيمي دارند. مطالعاتي در رابطه با، بررسي تأثير عوامل رشد پلاکتي بر روي تکثير و تمايز سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي است. به‌طورکلي عوامل رشد پلاکتي را مي‌توان جايگزين سرم در محيط کشت سه‌بعدي نمود. اين عوامل محيط مناسبي را براي رشد سلول‌هاي مزانشيمي فراهم مي‌سازند. توانايي تمايز استئوژنيک سلول‌هاي مزانشيمي در اين محيط حفظ مي‌شود.(??)، (??)

?-?? عصاره پلاکتي
به‌منظور روشن شدن نقش پلاکت‌ها در بازسازي بافت، يک مشتق ديگر از پلاکت به نام عصاره پلاکتي در شرايط invitro و invivo مورد ارزيابي قرار گرفت.
اين فرآورده محصولي است که از پلاسماي غني از پلاکت تهيه مي‌شود که تحت پروسه‌ايي (فيزيکي- شيميايي) غشاي پلاکتي دچار تخريب مي‌شود و باعث آزادسازي مواد محتوي گرانول‌هاي درون پلاکتي مي‌شود. (??)
?-?? تأثيرات عصاره پلاکتي روي ترميم زخم
مکانيسم ترميم مانند بسياري از فرآيندهاي بيولوژيکي، نمي‌تواند بر پاي? وقايع سلولي ساده‌اي صورت بگيرد. بلکه ترميم زخم شامل يکسري وقايع پيچيده سلولي و مولکولي تشکيل‌شده است اين فرايندها نياز به مشارکت هماهنگ از انواع سلول‌هاي مختلف ازجمله کراتينوسايت، فيبروبلاست، پلاکت، اندوتليال‌ها و سلول‌هاي التهابي مي‌باشند.(?)
در مطالعات گوناگوني اثر عصاره پلاکتي بر اين وقايع سلولي و مولکولي در سلول‌هاي متفاوتي مورد بررسي قرارگرفته است. (??)،(??)
يک ترميم زخم موفق به بازسازي ماتريکس خارج سلولي مربوط مي‌شود. و بازسازي فيبرهاي کلاژني توسط واسطه‌گرهايي به نام mmps18 صورت مي‌گيرد.(??)
mmps نماينده خانواده اندوپپتيداز19هاي وابسته به zn و ca هستند که در مجموع قادرند اغلب پروتئين‌هاي ماتريکس خارج سلولي را تخريب نمايند. mmps به‌عنوان يک پيش آنزيم ساخته‌ شده و معمولاً به‌وسيله يک پرو پپتيد فعال‌شده‌اند. دو عضو خانواده mmps ها mmp2 و mmp9 هستند که زير دسته ژلاتيناز مي‌باشند.
کلاژناز تيپ 4 به خاطر توانايي قابل‌توجه تخريب ژلاتين و کلاژن تيپ 4، جزء اصلي خانواده محسوب مي‌شوند. علاوه بر عملکرد تخريبشان اين آنزيم‌ها به‌طور مستقيم يا غيرمستقيم روي فعاليت چندين سيتوکين و مولکول زيستي واسطه‌گر براي التهاب و پروسه ترميم اثر مي‌گذارند. اين فاکتورها شامل اينترلوکين ?1 و اينترلوکين ? و TGF-? هستند.(??)
بنابراين عملکرد MMP در بازسازي ماتريکس و ترميم زخم به طرق مختلف صورت مي‌گيرد. اين‌که فاکتورهاي رشد نقش اساسي روي پروسه ترميم و تشکيل بافت جديد دارند، کاملاً پذيرفته‌شده است.
فاکتورهاي رشد تأثير بسيار زيادي روي پروسه‌هاي رايج ترميم بافت‌ دارند، که شامل رگ زايي، کموتاکسي20 و تکثير سلولي مي‌باشند. درعين‌حال اين‌ها سنتز و تخريب پروتئين‌هاي ماتريکس خارج سلولي را هم کنترل مي‌کنند.(??)
پلاکت‌ها به هموستاز کمک مي‌کنند. و همچنين حاوي فاکتورهاي رشد و سيتوکين ها نيز هستند. در دو دهه گذشته اطلاعات زيادي درباره نقش فيزيولوژي پلاکت‌ها در ترميم زخم يافته‌اند، که اين يافته‌ها منجر شد از پلاکت‌ها به‌عنوان ابزار درماني استفاده شود.(??)
در مطالعات invitro در جهت افشاي مکانيسم‌هاي سلولي و مولکولي ترميم زخم، به‌واسطه مشتقات پلاکتي نشان داده‌شده است که فرآورده عصاره پلاکتي، پاسخ ترميم را به‌واسطه کراتينوسايت‌ها، فيبروبلاست‌ها، ميوبلاست‌ها و اندوتليال‌ها افزايش مي‌دهد. اما مکانيسم‌هاي فعال کردن PL هنوز به‌خوبي مشخص نشده است. Mmp 9 به‌طور ويژه در لايه سلول‌هاي پايه اپيتليالي بيان ‌شده است. و همچنين mmp2 براي ترميم زخم‌هاي معمولي لازم نيست.
به همين علت يکي از مطالعات صورت گرفته اثر PL را روي mmps و تخريب ماتريکس خارج سلولي است. داده‌هاي اين بررسي نشان داده است که PL رابطه بين سلول‌هاي پوستي و ماتريکس خارج سلولي را تنظيم مي‌کند و مهم‌ترين اثرش up regulation mmp9 در کراتينوسايت‌ها است. که اين mmp9 موردبحث، در مهاجرت سلول‌هاي التهابي و جايگزيني در محل زخم دخيل است. بيان mmp9 سلول‌هاي اپيتليال در شروع مهاجرتشان القاشده، و پيشرفت اپيتليالهاي سطحي باعث پيشرفت بازسازي زخم مي‌شود.
به‌منظور روشن شدن برخي از مکانيسم‌هاي زيربنايي توسط پلاکت‌ها، با استفاده از سلول‌هاي کراتينوسايت haca T به نمايندگي از يک مدل آزمايشگاهي تکثير و مهاجرت کراتينوسايت را بررسي کردند. اين سلول‌ها قبلاً در مطالعات بهبود زخم به‌عنوان نماينده شاخص مهاجرت اوليه کراتينوسايتهاي انساني به شمار مي‌رفتند.
در آزمايش‌هاي سلول‌هاي haca T از عصاره پلاکتي به‌عنوان يک پانسمان در بالين مورداستفاده شد. در بررسي‌هايشان داده ‌شده است که در تيمار کراتينوسايت با PL (PI3K) نقش کمي در جلوگيري اسکار دارد.
همچنين مسيرهاي ErK1/2 و P38 بيان و القاي mmp را در کراتينوسايت‌ها تنظيم مي‌کنند، نهايتا از مجموع داده‌ها اين نتيجه برمي‌آيد که PL باعث فعال شدن مسيرهاي (ErK1/2 و P38) در کراتينوسايت مي‌شود.
اهميت P38 در تيمار PL از PI3K براي ترميم زخم بيشتر است. در يک بافت دچار جراحت شده، شناخت اينترکشن‌هاي بين ماتريکس و سلول، کليد مکانيسم‌هاي ترميم زخم است. به‌عنوان ‌مثال adhesion مرکزي مشتق شده از syndecan4 نقش عمده‌اي در ترميم زخم ايفا مي‌کند. syndecan4 يک تنظيم‌کننده در مدت ترميم بافت است، و نقش ضروري‌اش در ترميم زخم‌هاي پوستي و آنژيوژنز21 تأييدشده است. (??)
اطلاعات نشان مي‌دهند که syndecan4 در هر دو سلول کراتينوسايت و فيبروبلاست، احتمالاً به‌عنوان يک نشانه براي تحول در تغيير فازهاي ترميم زخم بکار مي‌روند. به‌طور خاص اثر PL روي syndecan4 در کراتينوسايت‌ها باعث تغيير پروسه هموستاز به پروسه اپيتليوم سازي مجدد22 مي‌شود.
همچنين يکي ديگر از اثرات PL روي syndecan4 اين است که باعث افزايش سرعت مهاجرت کراتينوسايت‌ها و فيبروبلاست ها به ناحيه زخم مي‌شود. به همين علتsyndecan4 به‌عنوان يک مارکر براي خصوصيات ترميم زخم به شمار مي‌رود. همچنين PDGF در دو مرحله رونويسي و ترجمه syndecan4 را در فيبروبلاست پوستي انسان بالغ، تنظيم مي‌کند. (??)
در مورد ورود کراتينوسايت‌ها به ناحيه زخم up regulation mmp9 نيز نقش کمکي دارد. در مقابل فقدان تنظيم ژلاتيناز در فيبروبلاست همزمان با تحريک سنتز کلاژن تيپ 3 همراه مي‌شود، که اين نشانگر اين امر است که PL فعاليت تخريب ماتريکس خارج سلولي پيشين بافت التهابي را تنظيم مي‌کند. درنهايت مي‌توان نتيجه گرفت که PL در پروسه ترميم زخم به‌وسيله سرعت بخشيدن انتقال فاز التهابي به فاز شکل‌گيري بافت جديد، قادر است که زخم را بهبود ببخشد و از ايجاد اسکار جلوگيري کند.
تأثيرات مختلف PL روي انواع سلول‌ها بيانگر اين است، که فاکتورهاي رشد و سيتوکين هاي درون PL هماهنگ‌کننده اصلي مسير ترميم زخم است.(??) در بافت جراحت يافته به‌محض شروع جراحت، آبشار وقايعي مثل التهاب، تشکيل بافت جديد و جايگزيني بافت جديد رخ مي‌دهد، که به‌واسط? يک الگويي از مسيرهاي سيگناليگ اتفاق مي‌افتد.
اين واسطه‌گرها شامل فاکتورهاي رشد و سيتوکين‌ها هستند که باعث تحريک فعاليت‌هاي درون‌سلولي مي‌شوند، که به‌عنوان فرايند ترميم شناخته‌شده‌اند. (??)
در تيمار سلول‌هاي Haca T با PL نشان داده‌شده است که PL هيچ اثر سمي روي سلول‌هاي کراتينوسايت ندارد، و اين عدم سمي بودن PL باعث عدم توقف ترميم زخم مي‌شود. اولين مرحله فوري ترميم زخم، پوشاندن منطقه زخم به‌وسيله مهاجرت سلول‌هاي اپيتليالي و مرحله بعدي تکثير سلولي است. سلول‌هاي کراتينوسايت لبه زخم، به‌محض ايجاد زخم فعال مي‌شوند و اتصالات بين سلولي خودشان را مي‌شکنند و به نظر مي‌رسد که با ايجاد پاهاي کاذب شروع به خزيدن مي‌کنند، به‌طوري‌که براي بازگرداندن تمام اپيتليال بين منطقه زخم پراکنده مي‌شود.(??)
نتايج به‌دست‌آمده از مطالعات تأييد مي‌کند که PL باعث تحريک کراتينوسايت‌ها به بستن زخم به‌وسيلهي پراکنده کردن آن‌ها مي‌شود. علاوه بر تأثير PL روي مهاجرت کراتينوسايت، مکانيسم مسير سيگنالينگ دخيل در اين امر نيز مورد بررسي قرارگرفته شده است. کلسيم خارج سلولي نقش اصلي در جايگزيني در پروسهي ترميم بافت و مهاجرت سلول‌هاي اپيتليالي دارد. همچنين کلسيم آزاد سيتوسوليک مهاجرت، تکثير و تمايز سلولي را تنظيم مي‌کند. به‌طور ويژه کمبود سيگنال‌هاي کلسيمي باعث تأخير در ترميم زخم در سلول‌هاي موشي مي‌شود. (??)
در سلول‌هاي اپيتليالي برونشيال انسان، توسط رسپتورهاي اختصاصي بااتصال به کلسيم درون‌سلولي به ترميم زخم کمک مي‌کنند. در مطالعات انجام‌ شده نشان داده‌اند که کلسيم درون‌سلولي در مکانيسم‌هاي ترميم زخم کاملاً درگير است. (??)
نقش کلسيم سيتوزولي در PL که باعث ارتقا ترميم زخم شده بود، توسط تصويربرداري canfocal تأييد شده است و ديناميک بودن سلول‌هاي کراتينوسايت در اين تصويربرداري کاملاً قابل ‌مشاهده است. ديگر اجزاي سيگنالينگ سلولي درگير در ترميم زخم، MAPKs شناخته‌ شده‌اند. که فعاليت آن‌ها براي پروسه ترميم زخم يک عملکرد ضروري محسوب مي‌شود.
در بررسي‌هاي صورت گرفته نشان داده ‌شده است که تيمار سلول‌ها با PL، مسير سيگنالينگ P38 نسبت به 2/1 Erk سريع‌تر فعال مي‌شود. فعاليت P38 باعث مهاجرت سلولي مي‌شود در حالي ‌که فعاليت 2/1 Erk موجب تحريک تکثير سلولي مي‌گردد.
يکي ديگر از مسيرهاي فعال مسير PI3K/AKT است، که يک جزء حياتي براي تکثير و بقاي سلول‌هاي اپيتليال به شمار مي‌رود. نقش PI3K/AKT در بهبود سلول‌هاي بدن ازجمله سلول‌هاي روده، سلول‌هاي اپيتليال قرنيه و اپيتليال رنگ‌دانه چشم گزارش ‌شده است.(??)


پاسخ دهید