1-9-1-5: تعداد کپي جايگاه CAP24
1-9-1-6: تکامل ژنوم سويه هاي کپسول دار هموفيلوس آنفلونزا25
1-9-1-7: ژنوتيپ هاي HIB27
1-10: روش هاي تعيين تعداد کپي جايگاه CAP در ژنوم هموفيلوس آنفلونزا:28
1-11: REAL-TIME PCR28
1-11-1: تعريف و مفهوم :28
1-11-2: مزاياي روش REAL-TIME PCR:29
1-11-3: انواع روش هاي REAL-TIME PCR:29
1-11-4: روش هاي تعيين کميت با REAL-TIME PCR:32
1-11-4-1: ABSOLUTE QUANTIFICATION :32
1-11-4-2: چگونگي رسم يک منحني استاندارد:32
1-11-4-3: RELATIVE QUANTIFICATION33
1-11-5: کاربرد هاي REAL-TIME PCR:34
1-12: بيان مساله34
1-13: ضرورت انجام تحقيق35
1-14: اهداف پژوهش36
فصل دوم: مروري بر متون گذشته
2-1: مطالعات انجام شده در ايران38
2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ايران39
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1: محيط هاي کشت43
3-1-1: محيط کشت شکلات آگار43
3-1-1-1: مواد و تجهيزات مورد نياز43
3-1-1-2: روش تهيه 1000 ميلي ليتر محيط کشت شکلات آگار43
3-1-2: محيط کشت آگار خون دار44
3-1-2-1: روش تهيه 1000 ميلي ليتر محيط کشت شکلات آگار44
3-1-3: محيط کشت BHI+ SUPPLEMENT مايع44
3-1-3-1: مواد و دستگاه هاي مورد نياز44
3-1-3-2: روش تهيه 500 ميلي ليتر محيط کشت BHI+ SUPPLEMENمايع44
3-2: کشت نمونه ها45
3-3: فريز کردن باکتري45
3-3-1: مواد و تجهيزات لازم45
3-3-2: روش فريز کردن45
3-4: شناسايي عمومي هموفيلوس آنفلونزا46
3-4-1: تست نياز هاي غذايي46
3-4-2: رنگ آميزي گرم46
3-4-2-1: مواد و تجهيزات لازم46
3-4-2-2: روش رنگ آميزي گرم46
3-5: واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR)47
3-5-1: استخراج DNA از باکتري به روش جوشاندن47
3-5-1-1: مواد و تجهيزات لازم47
3-5-1-2: روش استخراج48
3-5-2: پرايمرها48
3-5-2-1: آماده سازي پرايمرها49
3-5-3: برنامه PCR49
3-5-4: تهيه مستر ميکس PCR50
3-5-4-1: مواد و تجهيزات لازم50
3-5-4-2: روش تهيه مسترميکس50
3-5-5: تهيه 500 ميلي ليتر بافر TAE 10X53
3-5-5-1: مواد و تجهيزات لازم53
3-5-5-2: روش تهيه بافر53
3-5-6: الکتروفورز محصول PCR53
3-5-6-1: مواد و تجهيزات مورد نياز53
3-5-6-2: تهيه ژل آگارز جهت الکتروفوز53
3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR54
3-6: استخراج PRP54
3-6-1: مواد و تجهيزات مورد نياز54
3-6-2: تهيه ML50 محلول CTAB 0.5 M54
3-6-3: تهيه ML 50 محلول NACL 0.4 M55
3-6-4: روش استخراج PRP55
3-7: اندازه گيري PRP به روش بيال56
3-7-1: مواد و تجهيزات لازم56
3-7-2: روش اندازه گيري PRP56
3-8:تعيين تعداد کپي CAP با استفاده از REAL-TIME PCR:57
3-8-1: مواد و تجهيزات لازم:57
3-8-2: شرايط واکنش:57
3-8-3: کميت سنجي مطلق(ABSOLUTE QUANTIFICATION):59
3-8-3-1: انجام و تخليص محصول PCR براي منحني استاندارد59
3-8-3-2: تهيه منحني استاندارد60
3-8-4: کميت سنجي نسبي (RELATIVE QUANTIFICATION):62
3-9: تعيين ژنوتيپ نمونه ها با استفاده از PCR :62
فصل چهارم: نتايج
4-1: نتايج روش هاي تشخيص عمومي65
4-1-1: نتايج نياز غذايي65
4-1-2: نتايج رنگ آميزي گرم65
4-2: نتايج آزمون PCR66
4-2-1: تاييد هموفيلوس آنفلونزاي کپسول دار بودن نمونه ها66
4-2-2: تاييد تيپ B بودن نمونه ها68
4-2-3: نتيجه نهايي PCR69
4-2-4: مشاهده سوش جهش يافته HIB? در ميان نمونه ها72
4-3: نتايج سنجش PRP به روش بيال72
4-4: نتايج REAL-TIME PCR73
4-4-1: کميت سنجي نسبي:74
4-4-2: کميت سنجي مطلق:77
4-5: نتايج تعيين ژنوتيپ:82
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
5-1: بحث و نتيجه گيري84
5-3: پيشنهادات87
منابع ……………………………………………………………………………………………………………. 89
خلاصه انگليسي98
فهرست جداول
جدول 1-1: نياز گونه هاي مختلف هموفيلوس به فاکتورهاي مختلف به فاکتورهاي X و V7
جدول 1-2: بيوتايپ هاي هموفيلوس آنفلونزا8
جدول 3-1: ليست پرايمرها براي تاييد HIB48
جدول 3-2: برنامه PCR50
جدول 3-3: مواد PCR52
جدول3-4: پرايمرهاي اوليگونوکلئوتيدي استفاده شده براي REAL TIME PCR58
جدول3-5: مواد واکنش براي REAL-TIME PCR61
جدول3-6 : برنامه واکنش REAL-TIME PCR61
جدول 3-7: پرايمر هاي مورد استفاده براي تعيين ژنوتيپ نمونه هاي منتخب63
جدول 3-8: برنامه دمايي واکنش PCR براي پرايمرهاي K و L63
جدول 4-1: ليست نمونه ها و نتايج PCR70
جدول 4-2: ميزان PRP نمونه هاي هموفيلوس آنفلونزا تيپ B73
جدول 4-3 : نمونه هاي منتخب و ميزان PRP74
جدول4-4: کميت سنجي نسبي ژن RPOB و قطعه IS106 توسط REAL-TIME PCR75
جدول4-5: کميت سنجي نسبي ژن RPOB و ژن CAPB توسط REAL-TIME PCR75
جدول4-6: نتايج مربوط به منحني استاندارد جايگاه RPOB78
جدول 4-7: نتايج مربوط به منحني استاندارد جايگاه CAPB78
جدول 4-8: نتايج مربوط به منحني استاندارد جايگاه IS101678
جدول4-9: نتايج کميت سنجي مطلق (تعداد کپي) جايگاه هاي RPOB, IS1016 و CAPB 79
جدول 4-10 : تعداد کپي جايگاه هاي CAPB و IS1016 نسبت به جايگاه تک کپي RPOB 80
فهرست تصاوير
شکل1-1: انتشار باسيل هاي گرم منفي، هموفيلوس و ساير باکتريهاي نرمال و سخت رشد5
شکل 1-2: تست نوارهاي X ، V و XV7
شکل 1-3: ساختار پلي ساکاريد هاي کپسولي هموفيلوس آنفلونزا (تيپ هاي A-F)10
شکل 1-4: تظاهرات کلينيکي بيماريهاي با عامل HIB بصورت درصد14
شکل 1-5: کشورهايي که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسيناسيون عليه HIB پيوستن18
شکل 1-6: نقشه ژنتيکي حلقوي HAEMOPHILUS INFLUENZA RD20
شکل 1-7: ساختار ژنتيکي جايگاه CAP در هموفيلوس آنفلونزا سروتايپ هاي A,B,C,D,E,F21
شکل 1-8: جايگاه CAP و ژن هاي تشکيل دهنده24
شکل 1-9 : درخت تکاملي سويه هاي کپسول دار هموفيلوس آنفلونزا26
شکل1-10 : تفاوت هاي بين ژنوتيپ I و II در جايگاه CAP28
شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سايبرگرين30
شکل1-12: مکانيسم عمل SYBR GREEN به عنوان عامل متصل شونده به DNA31
شکل1-13: رسم منحني استاندارد.33
شکل 3-1: ويال هاي آماده براي PCR روي يخ52
شکل 4-1: رشد باکتري در حضور ديسک XV و عدم رشد در حضور ديسک X و V65
شکل 4-2: رنگ آميزي گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسيل هاي گرم منفي66
شکل 4-3: نتايج PCR براي ست پرايمر A و B 67
شکل 4-4: نتايج PCR براي ست پرايمر C و D69
شکل 4-5: مدل هاي پيشنهادي براي جايگاه CAPB در نمونه هاي انتخاب شده81
شکل4-6: نتايج PCR تعيين ژنوتيپ نمونه ها82
فهرست نمودارها
نمودار 4-1: بيان نسبي CAPB نسبت به ژن مرجع RPOB76
نمودار 4-2: بيان نسبي IS1016 نسبت به ژن مرجع RPOB76
نمودار 4-3: تعداد کپي در دو جايگاه CAPB و IS1016 نسبت به جايگاه RPOB در نمونه ها80
خلاصه فارسي
هموفيلوس آنفلونزاي تيپ‌ب (Hib) از مهمترين عوامل ايجاد مننژيت باکتريال در نوزادان و کودکان مي‌باشد. مهمترين عامل بيماري‌زايي اين باکتري کپسول پلي‌ساکاريدي از جنس PRP مي‌باشد که توليد آن تحت کنترل گروهي از ژنها مي‌باشد که در جايگاهي به نام capb قرار دارند. واکسيناسيون عليه اين بيماري در بيشتر کشورهاي جهان انجام شده ولي ايران هنوز به طرح واکسيناسيون سراسري نپيوسته است، به همين دليل توليد واکسن بومي هموفيلوس آنفولانزا يک ضرورت محسوب مي‌شود. هدف از اين مطالعه آناليز مولکولي ژنوم باکتري براي انتخاب يک سويه بومي واکسينال مي‌باشد. در اين تحقيق ابتدا نمونه‌هاي مشکوک به روش PCR و با استفاده از 4 جفت پرايمر اختصاصي شناسايي شد، ميزان PRP نمونه‌ها به روش بيال اندازه‌گيري شد، سپس تعداد کپي جايگاه cap در نمونه‌هاي منتخب به روش Real Time PCR و با استفاده از 3 جفت پرايمر طراحي شده براي مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپي rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهايت ژنوتيپ نمونه‌هاي منتخب با استفاده از دو جفت پرايمر اختصاصي مشخص شد.از ميان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غير از هموفيلوس آنفلونزا و يک مورد Hib? تشخيص داده شد. از ميان 5 نمونه منتخب دو نمونه داراي 3 کپي از جايگاه cap بوده و 3 نمونه داراي دو کپي از اين جايگاه تشخيص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتيپ I تشخيص داده شدند. در اين مطالعه براي اولين بار در ايران تعيين تعداد کپي و ساختار ژنوم جايگاه cap در سويه‌هاي بومي انجام شد.
کلمات کليدي: هموفيلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژيت ، Hib
فصل اول
کليات
1-1: تاريخچه
هموفيلوس آنفلونزا براي اولين بار در سال 1892 به وسيله فايفر جدا گرديد و تا اوايل دهه 1930، اکثر دانشمندان آن را عامل مولد آنفلونزاي اپيدميک مي دانستند. زيرا عموماً همراه با اين بيماري بدست مي آمد(8). در سال 1933 مسلم گريد که عامل بيماري آنفلونزا ويروس است و اين باکتري يک مهاجم ثانوي در اپيدميها مي باشد(1). البته در پاندمي هاي اخيري که ويروس آنفلونزا عامل آن بوده، نقش نزديک از اين باکتري با ويروس آنفلونزا ديده نشده است و بدين دليل مسئله سينرژيسمي بين ويروس و باکتري در بيماري هاي انساني ناشناخته به نظر مي رسد. بنابر اين نام آنفلونزا اهميت اتيولوژيک ندارد(8). آنفلونزا معمولا منصوب به عنوان ” flu”، يک بيماري ويروسي است که بوسيله التهاب حاد مسير هوايي ناحيه فوقاني دستگاه تنفسي مشخص مي گردد. علائم، اغلب با التهاب شديد غشاء مخاط بيني، سردرد، برونشيت و درد عضلاني عمومي شديد1 پيشرفت مي کند(48).
کاملترين مطالعات توسط مارگارت پيتمن بين سالهاي 1930 تا 1940 صورت گرفت ، او فيزيولوژي، بيماريزايي، مصونيت، اپيدميولوژي و خصوصيات اين باکتري را به صورت کامل شرح داد(1). نام جنس هموفيلوس از دو ريشه يوناني هم 2به معناي خون و فيلوس 3به معناي دوست داشتن گرفته شده است(20) . بر اساس کتاب باکتريولوژي برِگِي4، 10 گونه از هموفيلوسها در ارتباط با انسانها نام گذاري شده اند که يکي از آنها گونه آنفلونزا مي باشد. بعلاوه 6 گونه نيز در ارتباط با حيوانات بوده و 3 گونه نيز حالت نامشخص دارند.
1-2: خصوصيات عمومي جنس هموفيلوس:
جنس هموفيلوس شامل باکتري هاي کوکوباسيلي يا ميله اي شکل، گرم منفي، و پلئومورفيک بوده که در اسمير هاي مستقيم ممکن است شکل آنها در زير ميکروسکوپ، از کوکوباسيل هاي کوچک تا فيلامنت هاي بلند متفاوت باشد(20). ابعاد آنها به ندرت از 3/0 × 5/1 ميکرون تجاوز ميکند. دو انتهاي سلول آنها گرد بوده و کپسول در صورت مشاهده با ميکروسکوپ در اشکال صاف وجود دارد(8). در نمونه هاي حاصل از عفونت هاي حاد، ارگانيسم ها به صورت باسيل هاي کوکوئيدي شکل کوتاه هستند که گاهي اوقات بصورت دوتايي يا زنجيره کوتاه قرار ميگيرند(2). دو جنس هموفيلوس و پاستورلا، به خانواده پاستورلاسه تعلق دارند. از نظر خصوصياتي، اعضاي خانواده پاستورلاسه، گرم منفي، پلئومورفيک، کوکوئيدي، غير متحرک، هوازي يا بي هوازي اختياري بوده، نيتريت ها را در اثر احياء نيتريت ها بدست مي آورند و اکسيداز و کاتالاز + مي باشند. شکل (1-1) شيوع اين ارگانيسمهاي سخت رشد را در ارتباط با ديگر باسيل هاي گرم منفي يافت شده در نمونه هاي کلينيکي نشان مي دهد(48).
همانطور که گفته شد، هموفيلوس باکتري هوازي اختياري است، اما به طور ضعيف در غياب اکسيژن رشد مي کند. افزايش 10-5 % Co2 بهمراه انکوباسيون، رشد بسياري از سويه ها را افزايش مي دهد. مقدار گوانين+ سيتوزين DNAي جنس هموفيلوسmole %44-37 مي باشد(48) .
شکل1-1: انتشار باسيل هاي گرم منفي، هموفيلوس و ساير باکتريهاي نرمال و سخت رشد

از حدود 17 گونه از هموفيلوس هاي شناخته شده عده اي جزء فلور طبيعي دهان و نواحي فوقاني دستگاه تنفس انسانها و عده اي نيز در حيوانات يافت مي شوند(8). حدود 10% کل فلور باکتريايي دائمي دستگاه تنفسي فوقاني را هموفيلوس ها تشکيل مي دهند(38). برخي از آنها در انسان بيماري زا مي باشند(8). گونه اصلي بيماريزا هموفيلوس آنفلونزاست که بطور طبيعي در سيستم حلقي- دهاني برخي افراد سالم يافت مي شود. بعضي از سويه هاي آنها داراي کپسول وبرخي ديگر فاقد آن هستند، که دسته بدون کپسول داراي قدرت بيماريزايي ضعيفتري نسبت به سويه هاي کپسولدار مي باشند. هموفيلوس آنفلونزا در انسان ايجاد عفونت مي کند(45) و مخزن حيواني ندارد(10).
از گونه هاي عمده ساکن در دستگاه تنفسي فوقاني، گونه پاراآنفلونزاست که 4/3 % از کل ميکروفلورهاي هموفيلوس را در بر ميگيرد. سويه هاي هموفيلوس آنفلونزاي بدون کپسول معمولا چندين بيوتايپ داشته و در فارنکس بيشتر کودکان سالم يافت مي شوند. اما به طور نرمال کمتر از 2% فلورهاي باکتريايي کل را تشکيل مي دهد. با افزايش سن افراد هموفيلوس آنغلونزا فراواني کمتري را به عنوان فلور حلق نشان مي دهد(38).
1-3: نيازهاي غذايي
هوفيلوس آنفلونزا يکي از پر نيازترين باکتري ها بوده و به وجود خون در محيط کشت نياز دارد(8). عدم توانايي رشد هموفيلوس در غياب خون يا فرآورده هاي آن، مربوط به دو نياز غذايي است که اولي، هِمين يا هِم شناسايي شد که به آن فاکتور X مي گويند(73). اين فاکتور به حرارت مقاوم بوده و براي رشد هوازي ارگانيسم مورد نياز است(9). فاکتور X همچنين ميتواند پروتوپورفيرين IX و ديگر ترکيبات منسوب به آن که داراي آهن هستند را شامل شود(17). اين نوع ترکيبات براي سنتز آنزيم هاي تنفس هوازي ضروري بوده، از اين رو، سويه ها براي رشد بي هوازي، به فاکتور X نيازي ندارند. عقيده بر اين است که هِم براي سنتز کاتالاز لازم بوده و ميتوان به جاي آن سيستئين به کار برد. سيستئين، پراکسيد را احياء کرده و نياز به کاتالاز را برطرف مي سازد(8). احتياج به اين گروه از ترکيبات، به دليل ناتواني سويه هاي وابسته به X است که تواناي تبديل ALA 5 به پروتوپورفيرين را دارا نمي باشند، که پروسه اي داراي چندين مرحله با آنزيم هاي مختلف مي باشد(17).
دومين فاکتوري که برخي از گونه هاي هموفيلوس براي رشد به آن وابسته است. نيکوتين آميد دي نوکلئوتيد (NAD) و يا نيکوتين آميد دي نوکلئوتيد فسفات شناسايي شده که به آن فاکتور V مي گويند. (17،73). لازم به ذکر است که اسيد نيکوتينيک يا نيکوتين آميد نميتواند جايگزين اين فاکتور شود. ظاهراً مولکول کوآنزيم کامل را بايد فراهم کرد و بنظر مي رسد که اين ماده حساس به حرارت، همين فاکتور V نام برده مي باشد که در عصاره مخمر، انواع سبزيجات و همچنين خون کامل يافت مي شود(8).
هر دو فاکتور X و V در داخل گلبولهاي قرمز خون يافت شده و براي رشد در محيط لازم مي باشند(20). البته بايد خاطر نشان کرد که گونه هاي مختلف ممکن است به يکي از فاکتورها و يا هر دوي آنها نيازمند باشند که الگوي وابستگي به X و V يا XV معياري است براي تمايز بين گونه ها(جدول 1-1).
جدول 1-1: نياز گونه هاي مختلف هموفيلوس به فاکتورهاي مختلف به فاکتورهاي X و V
Haemophilus speciesGrowth Factor RequirementsXVHaemophilus influenza++Haemophilus haemolyticus++Haemophilus ducreyi+-Haemophilus parainfluenzae-+Haemophilus parahaemolyticus-+Haemophilus segnis-+Haemophilus paraphrophilus-+Haemophilus aphrophilus–
ليز شدن گلبولهاي قرمز توسط حرارت در زمان تهيه شکلات آگار باعث آزادسازي فاکتورهاي رشدي X و V خواهد شد. همچنين آنزيم هاي هيدروليز کننده فاکتور V نيز غير فعال مي شوند(20).
احتياجات به دو فاکتور X يا V يا XV معمولا با به کار گيري تست ديسک در جايي که رشد و يا عدم رشد در اطراف ديسک هاي کاغذي را نشان مي دهد مشاهده مي شود(شکل 1-2).
شکل 1-2: تست نوارهاي X ، V و XV
1-4: دسته بندي و تيپ بندي هموفيلوس آنفلونزا
1-4-1: بيوتايپ هاي هموفيلوس آنفلونزا:
باکتري هموفيلوس آنفلونزا بر اساس 3 تست بيوشيميايي Indole, Urease, Ornithine decarboxylase به هشت بيوتايپ (زيست گروه) مختلف تقسيم مي شود (جدول 1-2). سويه هاي مهاجم ايجاد کننده مننژيت اغلب جزء بيوتايپ I هستند در حالي که سويه هاي بدون کپسول (NTHi) ايجاد کننده بيماري، عموما جزء بيوتايپ II و III هستند.
ارتباط نزديکي بين محل جداسازي هموفيلوس آنفلونزا و بيوتايپ هاي آن وجود دارد، به طوري که بيوتايپ I بيشتر عامل سپسيس و مننژيت است. عفونت هاي مجاري تنفسي، گوش مياني و چشم عموما توسط بيوتايپ هاي II و III ايجاد مي شود و بيوتايپ IV بيشتر در ارتباط با عفونت هاي تناسلي است(53).
جدول 1-2: بيوتايپ هاي هموفيلوس آنفلونزا
Urnithine decarboxylaseUreaseIndoleBiotype+++I-++II-+-III++-IV+-+V+–VI–+VII—VIII
1-4-2: سروتايپ هاي هموفيلوس آنفلونزا:
در سال 1930 دو گروه اصلي براي هموفيلوس آنفلونزا در نظر گرفته شد:
– سويه هاي کپسول دار(encapsulate)
– سويه هاي بدون کپسول (unencapsulate)
سويه هاي کپسول دار بر اساس آنتي ژن کپسولي متمايز خود دسته بندي شدند. تا کنون شش سروتايپ کپسول دار از هموفيلوس آنفلونزا به رسميت شناخته شده و به نام هاي a,b,c,d,e,f نام گذاري شده اند(62).
تنوع ژنتيکي در ميان سويه هاي بدون کپسول بسيار بيشتر است .سويه هاي بدون کپسول ، nontypeable (NTHi) ناميده مي شوند. زيرا قابل تيپ بندي بر اساس کپسول نيستند.
1-4-3: ديگر سيستم هاي دسته بندي:
سويه هاي کپسول دار همان طور که شرح داده شد بر اساس تفاوت در ساختار پلي ساکاريد کپسولي به 6 زيرگروه تقسيم مي شوند. سيستم هاي ديگر دسته بندي به سويه هاي بدون کپسول هموفيلوس آنفلونزا مي پردازد که شامل: بيوتايپينگ، تفاوت بر اساس وزن مولکولي پروتئين غشاء بيروني (نا همگني آنتي ژني)، دسته بندي بر اساس ناهمگني آنتي ژني ليپواوليگوساکاريدي(LOS) ، دسته بندي بر اساس تفاوت هاي ژنتيکي با استفاده از الکتروفورز، دسته بندي بر اساس روش RFLP و دسته بندي با استفاده از PCR مي باشد(61).
1-5: خصوصيات پاتوژنيک
1-5-1: آنتي ژن کپسولي
سويه هاي کپسول دار هموفيلوس آنفلونزا دار بر اساس پلي ساکاريد گروه هاي سرولوژيکي هموفيلوس آنفلونزا به 6 سروتيپ a,b,c,d,e,f تقسيم مي شوند(18). در شکل (1-3) ساختار کپسول سروتايپها نشان داده شده اند.
شکل 1-3: ساختار پلي ساکاريد هاي کپسولي هموفيلوس آنفلونزا (تيپ هاي a-f)

آنتي ژن کپسولي پلي ساکاريد در واقع پليمري است که از دي ريبوزفسفات که به آن پلي ريبو فسفات (PRP) مي گويند (18). مطالعات بعدي ريبيتول را به عنوان يک ترکيب سازنده اضافي بر اين ساختار تشخيص داد و همچنين ساختاري را براي اين پلي ساکاريد پيشنهاد کرد که بر پايه ترکيبي اکي مولار از ريبوز، ريبيتول و فسفات مي باشد(22).
به نظر مي رسد که پلي ساکاريد کپسولي (CP) اين ارگانيسم، اساسي ترين شاخص بيماري زايي در عفونت هاي سيستميکي مي باشد که توسط هموفيلوس آنفلونزا تيپ b به وجود مي آيند(12).
کپسول داراي خاصيت ناپايداري و بي ثباتي است به اين معنا که کشت هاي متوالي6 ممکن است باعث از دست رفتن کپسول، پيدايش رشد ضعيف و اشکال پلئومورفيک يا چند شکلي شوند. موتانتهاي فاقد کپسول7 که داراي کلني هاي با ظاهر خشن مي باشند، مواد کپسولي را توليد کرده اما آن را به سطح خارجي باکتري انتفال نمي دهند(18). در 5/0 – 1% از سوش هاي سيروتايپ b به صورت خود به خودي بيان کپسول خود را از دست مي دهد. ولي در سيروتايپ هاي غير از b از دست دادن کپسول تا کنون گزارش نشده است (34)
تيپ هموفيلوس آنفلونزاي کپسول دار را مي توان به کمک آنتي سرم هاي اختصاصي از طريق آزمايشات تورم کپسولي تعيين نمود. اين آزمون، مشابه کوالانگ در پنوموکوکها مي باشد. به وسيله روش ايمنوفلورسانس نيز مي توان بطور مشابهي تيپ باکتري را تعيين نمود. اغلب هموفيلوس آنفلونزاهاي فلور طبيعي مجاري تنفسي فوقاني، فاقد کپسول هستند(2). کپسول در غياب آنتي بادي ضد کپسولي فاکتور عمده ويرولانس محسوب مي شود(8).
1-5-2: فاکتورهاي ويرولانس و آنتي ژن هاي ديگر:
در ساختمان آنتي ژن سوماتيک هموفيلوس آنفلونزا حداقل دو پروتئين وجود دارد. ماده P که قسمت اعظم وزن باکتري را تشکيل مي دهد و ماده M که آنتي ژن سطحي ناپايدار مي باشد.
از کشت مايع اين باکتري، معمولا اندوتوکسين ليپوپلي ساکاريدي خاصي به دست مي آيد که ماهيت آنتي ژني آن مشابه نايسريا مي باشد(9). از ديگر فاکتورهاي ويرولانس اين ارگانيسم بعد از کپسول، مي توان IgA پروتئاز، پروتئين هاي غشاء خارجي (OMP) ، ليپواليگوساکاريد (LOS) و پروتئين هاي ادهسين8 يا چسبندگي را نام برد(18).
1-5-3: عوامل تشکيل کلني و ويرولانس
اولين مرحله در بيماري زايي کلونيزه شدن باکتري در قسمت هاي فوقاني دستگاه تنفس است. در اين پروسه، براي اينگه هموفيلوس آنفلونزا بتواند ايجاد عفونت هاي سيستميک کند،بايد چسبندگي به سطوح مخاطي دستگاه تنفسي را به دست آورد، سپس از ميان سلولهاي اپيتليال و اندوتليال گذشته، پس از نفوذ به خون در بافتهاي ديگر مستقر شده و در اندام هدف صدمه به سلولها را ايجاد کند.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

پيلي: چسبندگي به وسيله پيلي در بسياري از سويه ها تسهيل مي شود. اگرچه اين ساختارها ممکن است تنها عامل چسبندگي نباشند، زيرا در برخي سويه هاي فاقد پيلي قدرت چسبندگي به سلولهاي اپيتليال مسير هوايي وجود دارد(60). به دنبال تشکيل کلني ممکن است تغيير در فنوتيپ پيلي دار به نوع فاقد پيلي رخ دهد که رويداد مهمي محسوب مي شود، زيرا در ظهور بعدي بيماري واريانت هاي بدون پيلي توانايي بهتري در حمله به اپيتليوم دارا هستند(27،44).
کپسول: مهمترين نقش را در پاتوژنز بيماري تهاجمي بازي ميکند و داراي خواص ضد فاگوسيتي در غياب آنتي بادي هاي ضد کپسولي و همچنين داراي فعاليت ضد کمپلماني مي باشد (50،36). مطالعات نشان ميدهد که بيشتر سويه هاي فاقد کپسول داراي خاصيت چسبندگي به سلولهاي اپيتليال انسان مي باشند. در حالي که اکثر سويه هاي سروتيپ b فاقد اين خاصيت هستند. عدم توانايي چسبندگي در سروتايپ b ممکن است عاملي باشد براي ايجاد عفونت هاي سيستميک به وسيله اين سروتايپ، و وجود توانايي چسبندگي در سويه هاي بدون کپسول نيز ممکن است توضيح دهنده عفونت هاي لوکاليزه و محدود باشد(48).
پروتئين هاي غشاء خارجي و ليپواليگوساکاريد (LOS): اگرچه نقش اين آنتي ژنها بطور کامل شناخته شده نيست، ولي مي توان گفت که آنتي بادي هايي که مستقيما بر ضد اين آنتي ژنها توليد مي شوند نقش مهمي در ايمني انسان بازي مي کنند. هر کدام از اين آنتي ژنها احتمالا مسئول توانايي هاي مختلفي مانند تهاجم، اتصال و عملکرد فاگوسيتي هستند. ليپواليگوساکاريد نيز داراي اثر فلج کننده و مختل کننده حرکت مژه هاي سلولهاي اپيتليوم دستگاه تنفسي مي باشند.
IgA پروتئازها (IgA Proteases): همانطور که مي دانيم ايمنوگلوبولين ترشحي کلاس A در سطوح موکوسي انسان يافت مي شود. از ميان همه گونه هاي هموفيلوس، تنها گونه آنفلونزا توليد IgA پروتئاز مي کند. اين آنزيم داراي توانايي شکستن IgA ترشحي بوده و توليد آن به اين ارگانيسم پتانسيل ويرولانس بيشتري مي بخشد (37،20).
1-6: علائم کلينيکي عفونتهاي هوفيلوس آنفلونزا تيپ b
بايد به اين مساله تاکيد داشت که همه سويه هاي هموفيلوس آنفلونزا داراي کپسول نمي باشند. بنابر اين دو نوع مسير براي بيماري هاي نسبت داده شده به اين ارگانيسم وجود دارد:
الف- بيماري هاي تهاجمي ايجاد شده توسط سويه هاي کپسولدار (قابل تيپ بندي) بخصوص سروتايپ b که در آنها، باکتري و انتشار از طريق خون در بدن نقش مهمي دارد.
ب- بيشتر عفونتهاي لوکاليزه را شامل مي شود که توسط سويه هاي غير کپسولدار (nontypeable) ايجاد شده و در داخل يا نزديکي راه هاي تنفسي پديد مي آيند.
مثال براي نوع اول بيماري هاي تهاجمي شامل: مننژيت، اپي گلوتيت، آرتريت، سلوليت و فارنژيت حاد، و مثال براي عفونت هاي لوکاليزه شامل: پنوموني و سينوزيت که خصوصا در بين بزرگسالان شايع مي باشد(شکل 1-4).
گاهي نيز استثناهايي در دسته بندي کپسولدارها و غير کپسولدارها در ايجاد بيماري بين کودکان و بزرگسالان اتفاق مي افتد(32).
شکل 1-4: تظاهرات کلينيکي بيماريهاي با عامل Hib بصورت درصد
به عنوان مثال برخي سويه هاي غير کپسولدار گاهي قادر به ايجاد مننژيت در بزرگسالان هستند به خصوص در افراد ناتوان يا با ضعف سيستم ايمني. علاوه بر آن مي توانند در نوزادان ايجاد کننده سپسيس و در کودکان عامل عفونت هاي تهاجمي دستگاه تنفسي تحتاني باشند. ديگر سروتايپ هاي هموفيلوس آنفلونزا نيز به ندرت در انسان بيماريزا هستند (10،74).
1-6-1: مننژيت
مننژيت مهمترين و خطرناکترين بيماري است که توسط هموفيلوس آنفلونزا ايجاد مي شود. سروتايپ b از هموفيلوس آنفلونزا معمول ترين عامل مننژيت در بين کودکان بين 3 ماه تا 6 سال مي باشد (75). مننژيت ناشي از اين باکتري شايع ترين شکل مننژيت سپتيک بوده که تقريبا در همه موارد به وسيله تيپ b ايجاد مي شود(8). بطور مشخص، مننژيت هموفيلوسي پس از بيماري ضعيف چند روزه رخ مي دهد و علائم بيماري ممکن است قطع شده و دوباره پديدار شود. مرگ و مير در ارتباط با هموفيلوسي حدود 5-3% مي باشد(25). علائم مننژيت ايجاد شده توسط اين باکتري با ساير مننژيتهاي باکتريايي در کودکان کمتر از 3 سال تفاوتي ندارد و مفصل در موارد کمتري گرفتار مي شوند(9).
در طي بيماري مننژيت با عامل هموفيلوس آنفلونزا تيپ b، به دنبال کلونيزه شدن، تهاجم به جريان خوني و در نتيجه انتشار باکتريمي اتفاق مي افتد. همچنين ارگانيسم در غشاء مخاط تنفسي شروع به تکثير مي کند.
از علائم اين بيماري مي توان سردرد، سفت شدن گردن9، تب وبي حالي، شوک و ديگر علائم رايج مننژيتي را نام برد(20). عواقب دراز مدت مننژيتي ناشي از اين باکتري پراهميت مي باشد. بازماندگان، قريب يک سوم عوارض عصبي و رواني از جمله کري، اختلال در بيان و ناهنجاري هاي رفتاري پيدا مي کنند و درصد کمي از بيماران نيز شديداً آسيب ديده و به مراقبت هاي ويژه نياز پيدا مي کنند(8).
1-7:درمان:
1-7-1: واکسن هاي موثر و مقايسه آنها
قبل از معرفي واکسن هاي موثر، تقريبا از هر 200 کودک بين 5-1 سال، 1 کودک مبتلا به بيماري هاي تهاجمي Hib مي شد. اما امروزه در کشوري مثل آمريکا، اين ميزان به 1 کودک در هر 100000 کودک تقليل يافته است. که معمولا اين ميزان ابتلا نيز با عاملي غير از سروتايپ b از اين ارگانيسم رخ مي دهد. اما متاسفانه هنوز در کشورهايي که توانايي اقتصادي براي واکسيناسيون عمومي موجود نيست، بيماري هاي با عامل Hib همچنان قرباني هاي زيادي دارد (78).
اولين نسل از واکسن هاي عليه بيماري هاي Hib، شامل پلي ساکاريدي خالص از جنس PRP با وزن مولکولي بالا بود که در سال 1985 در آمريکا معرفي شد (80). اما اين واکسن که اولين واکسن تحت ليسانس به حساب مي آيد مانند ديگر واکسن هاي پلي ساکاريدي، پاسخ ايمني به آن نيز وابسته به سن بود. بدين معني که با وجود تاثير قابل قبول در کودکان تازه به راه افتاده ، در نوزادان زير 18 ماه قادر به ايجاد حفاظت نبود. اين واکسن در سال 1988 از دور فروش خارج شد (76).
پس از ظهور کوتاه واکسن هاي پلي ساکاريدي ، نسل دوم واکسن هاي Hib به بازار آمد. اين نسل از واکسن‌ها کونژوگه اي بود از پلي ساکاريد PRP با يک حامل پروتئيني در حالت کوالانت بود.
اتصال پلي ساکاريد به حامل پروتئيني ، به طور چشمگيري باعث افزايش توانايي سيستم ايمني کودکان در شناسايي PRP و پاسخ به آن مي شود (79). امروزه سه نوع مختلف از واکسن هاي کونژوگه وجود دارد که در هر کدام يک نوع پروتئين در پروسه کونژوگه کردن استفاده شده است و شامل: توکسوئيد تتانوس (PRP-T)، پروتئين موتانت ديفتري(PRP-D) و پروتئين غشاء خارجي مننگوکوکي گروه b (PRP-ompc) است.
PRP-D (کپسول همراه با توکسوئيد ديفتري) در نوزادان، حتي بعد از تزريق 3 دوز، از کمترين ايمني زايي برخوردار بود. اما وقتي به عنوان يک بوستر در نوزادان 12-18 ماهه که در دوره اوليه سه تزريق آنها توسط PRP با کونژوگه ديگري بود، مورد استفاده قرار گرفت، ايمني زايي خوبي را از خود نشان داد (58).
PRP-ompc يا کپسول کونژوگه با پروتئين غشاء خارجي بدست آمده از مننگوکوک، تنها کونژوگه اي است که آنتي بادي بالايي را پس از اولين تزريق در نوزادان دوماه سبب مي شود. دوزهاي بعدي، افزايش نسبتا کمي را توليد کرده و آخرين تيتر حتي کمتر از بقيه.(24)
واکسن PRP-T و واکسن کونژوگه کپسول به همراه توکسين به دست آمده از موتانت ديفتري، هر دو آنتي بادي کمي را پس از تزريق به نوزادان 4-2 ماه توليد مي کنند. در حالي که ميزان آنتي بادي بالايي را پس از تزريق در 6 ماهگي توليد مي کنند. بنابر اين از نظر تئوري، يک تزريق اوليه PRP-ompc در 2 ماهگي و تزريق دوم با PRP-T و يا با PRP متصل به توکسين موتانت ديفتري در سن 6-4 ماهگي و سومين تزريق با PRP-D در 15-12 ماهگي، مي تواند پاسخ مطلوبي را به همراه داشته باشد (50).
جدا از هر نوع واکسني که براي دوزهاي اوليه انتخاب مي شوند، زماني که کودک در کمتر از 12 ماهگي است، تيترها به سرعت پايين مي آيند، مگر در زمان يک تزريق مجدد (بوستر) که معمولا در 15-12 ماهگي صورت مي پذيرد (56).
به منظور کاهش تعداد دفعات ضروري تزريق واکسن به کودکان نسل سوم اين واکسن ها به تاييد سازمان بهداشت جهاني (WHO10) رسيده که واکسني پنتاوالاني (پنج ظرفيتي) است که ترکيبي از واکسن هاي مختلف از جمله ديفتري، تتانوس، سياه سرفه و هپاتيت مي باشد، اما هنوز مدارک و شواهد کافي در مورد تفاوت اثر اين واکسن ها در مقايسه با واکسن هاي اختصاصي وجود ندارد (76، 77).
در مطالعه اي که بر روي نوزادان گامبيايي صورت گرفته است، اثر واکسن هاي کونژوگه Hib در اين کشور در حال توسعه نشان دهنده کاهش بيماري و جلوگيري از اکثر موارد مننژيتي و پنوموني مي باشد. بنابراين پيشنهاد شده است که اين واکسن ها در کشور هاي در حال توسعه، مرگ و مير ناشي از اين بيماري ها را در کودکان به طور قابل توجهي کاهش مي دهد (52).

شکل 1-5: کشورهايي که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسيناسيون عليه Hib پيوستند(36)
1-8: تشخيص:
تشخيص اين باکتري در آزمايشگاه به طور معمول با استفاده از دو روش کشت و تست آگلوتيناسيون لاتکس11 (LAT) انجام مي شود. روش مولکولي PCR نيز قابل انجام است که به صورت روتين در آزمايشگاه هاي تشخيصي انجام نمي شود.
1-8-1: روش کشت
کشت باکتريايي Hi بر روي آگار شکلاته به همراه فاکتور X 12 و V 13 در دماي 37 درجه سانتي گراد و غني از Co2 انجام مي شود. رنگ آميزي گرم و مشاهده ميکروسکوپي، باکتري را به صورت باسيل هاي گرم منفي نشان مي دهد.
باکتري از نظر توليد آنزيم هاي اکسيداز و کاتالاز، مثبت است.
در ناحيه هموليتيک استاف اورئوس14 در محيط بلاد آگار رشد مي کند زيرا در اين ناحيه به دليل هموليز خون، فاکتورV وجود دارد.
در محيط لوينتال15 سويه هاي کپسول دار کلني هاي با نماي رنگين کماني توليد مي کنند. محيط فيلدز آگار16 بهترين محيط براي جدا سازي اين باکتري مي باشد.
1-8-2: روش آگلوتيناسيون لاتکس (LAT)
روش حساس تري نسبت به کشت مي باشد زيرا اين روش بر پايه آنتي ژن هاي باکتري هاي زنده انجام مي شود که با آنتي بادي اختصاصي خود واکنش مي دهد .
نتايج در اين روش تحت تاثير مصرف آنتي بيوتيک ها قرار نمي گيرد. همچنين اين روش سريع تر از روش کشت بوده و قادر به تمايز سروتايپ هاي مختلف کپسول دار مي باشد. با اين حال نتايج آن نسبت به روش مولکولي از دقت کمتري برخوردار است (35).
1-8-3: روش مولکولي
واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR) بسيار حساس تر، اختصاصي تر و سريع تر از روش کشت و LAT مي باشد (35،51). طراحي پرايمر براي شناسايي مولکولي سروتايپ هاي هموفيلوس آنفلونزا براي اولين بار در سال 1990 توسط وَن کِتِل17 و همکاران انجام شد (71). با اين حال روش PCR هنوز به صورت روتين در آزمايشگاه ها مورد استفاده قرار نمي گيرد.
1-9: ژنوم هموفيلوس آنفلونزا:
هموفيلوس آنفلونزا اولين موجود زنده داراي توانايي تکثير مستقل است که ژنوم آن به طور کامل تعيين توالي شد. پروژه ژنوم هموفيلوس آنفلونزا در سال 1995 توسط ونتر18 همکاران انجام شد.
هموفيلوس آنفلونزا به اين دليل انتخاب شد که يکي از سرپرست هاي پروژه به نام هميلتون اسميت19 (برنده نوبل) يک دهه بر روي اين ميکروارگانيسم کار کرده بود و اطلاعات زيادي در مورد آن وجود داشت که براي موفقيت پروژه لازم بود.
ژنوم هموفيلوس آنفلونزا در يک کروموزوم حلقوي قرار گرفته که داراي 1830137 جفت باز است. اين تعداد نوکلئوتيد تشکيل 1740 ژن کد کننده پروتئين، 2 ژن کد کننده tRNA و 18 ژن کد کننده RNA را مي دهد.
براي توالي يابي ژنوم از تکنيک shutgun sequencing استفاده شد. اين پروژه يک سال طول کشيد و در اين مدت 24304 قطعه به صورت مجزا توالي يابي و سپس توسط نرم افزار کنار هم قرار داده شدند(72).
شکل 1-6: نقشه ژنتيکي حلقوي Haemophilus influenza Rd
1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلي ساکاريدي
انواع هموفيلوس آنفلونزاي کپسول دار داراي ژن هاي مشترک براي توليد کپسول پلي ساکاريد20 مربوط به خود هستند که در جايگاه cap (cap locus) قرار گرفته اند(42).
جايگاه cap يک منطقه 18kb است که در همه سروتيپ ها داراي سه منطقه عملکردي جداگانه به نام هاي منطقه I,II.III مي باشد (شکل 1-7).
شکل 1-7: ساختار ژنتيکي جايگاه cap در هموفيلوس آنفلونزا سروتايپ هاي a,b,c,d,e,f

منطقه I و III در همه سروتايپ هاي کپسول دار مشترک است و شامل ژن هايي است که براي توليد و ترشح کپسول پلي ساکاريدي ضروري هستند. مشابه اين ژن ها در باکتري هاي گرم منفي ديگر از قبيل
Escherichia coli, Neisseria meningitides, Actinobacillus pleuropnumoniae, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida ديده شده است. (63)
1-9-1-1: منطقه I
منطقه I داراي چهار ژن به نام هاي bexA,B,C,D مي باشد که براي توليد سيستم ترشح کپسول وابسته به ATP کد مي شوند و در انتقال پلي ساکاريد به سطح سلول باکتري نقش دارد (41) (شکل1-8).
1-9-1-3: منطقه II
منطقه II داراي چهار ژن بوده و در هر سروتايپ منحصر به فرد است21 و آنزيم هاي کد شده توسط اين منطقه باعث توليد دي ساکاريد اختصاصي هر سروتايپ مي شود(28،70).
اين ژنها در Hib به نام هاي bcs1,2.3.4 شناخته ميشوند. حرف اول (b) نشان دهنده نوع سروتايپ مي باشد و سروتايپ هاي ديگر نيز به همين ترتيب نام گذاري مي شود(شکل 1-8).
1-9-1-2: منطقه III
منطقه III شامل دو ژن به نام هاي hcsA و hcsB مي باشد که به نظر مي رسد در مراحل پليمريزاسيون کپسول و حتي در اصلاحات و ترشح پلي ساکاريد نقش داشته باشند (29)(شکل 1-8).
مطالعه سوکوپولوي22 و همکاران در سال 2006 نشان داد اين دو ژن به صورت مکمل در تسهيل انتقال کپسول پلي ساکاريدي به سطح سلول و ويرولانس باکتري نقش دارند. غير فعال کردن اين ژن ها به صورت جدا از هم و همزمان در اين مطالعه باعث تجمع پلي ساکاريد در فضاي پري پلاسمي سلول باکتري شد(67).
1-9-1-4: قطعه IS1016 23
همه سروتايپ ها حداقل يک کپي کامل از جايگاه cap دارند که به يک قطعه به نام IS1016 متصل است. در سوش هاي داراي بيش از يک کپي ، دو قسمت توسط يک قطعه IS1016 از هم جدا شده اند. يعني به ابتداي هر جايگاه cap کامل يک قطعه IS1016 متصل است(57) (شکل 1-11).
قطعه IS1016 باعث سهولت در مضاعف شدن جايگاه cap در طول همانند سازي کروموزوم هاي خواهري، تحت تحت اثر نوترکيبي نامساوي مي شود.
اين قطعه در اغلب سويه ها به جايگاه cap متصل بوده و گفته مي شود در يک سويه اجدادي از طريق جابه جايي24 به وجود آمده است.
اين عناصر باعث جابه جايي جايگاه cap به عنوان يک ترانسپوزون در درون کروموزوم مي شود و مي تواند باعث تکثير جايگاه cap در طول نوترکيبي همولوگ شده و منجر به افزايش توليد کپسول شود.
حذف شدگي در يکي از قطعات IS1016 به همراه بخشي از ژن bexA در Hib باعث ايجاد پايداري در ساختار دوتايي جايگاه cap مي شود(34). اين حذف شدگي باعث جلوگيري از حذف کپي ديگر bexA در طول نوترکيبي مي شود. سويه هاي داراي حذف شدگي در تمام دنيا گسترش پيدا کرده و در حال حاضر عامل اغلب عفونت هاي ايجاد شده توسط Hib هستند. به همين دليل به نظر مي رسد حذف شدن اين قطعه 1.2kb در سويه اجدادي يک نوع برتري زيستي به باکتري اعطا کرده است(40).
شکل 1-8: جايگاه cap و ژن هاي تشکيل دهنده
1-9-1-5: تعداد کپي جايگاه cap25


پاسخ دهید