1-2-1- روش هاي تكثير ايد نوكلئيك بر پايه PCR 17
1-2-2- بررسي روشهاي تکثير هم دما و مقايسه آنها با روش هاي مبتني بر PCR 19
1-3- بخش سوم: روش تکثير دايره اي چرخان RCA: 21
1-3-1- مشخصات روش RCA: 22
1-3-2- آنچه براي انجام واکنشRCA لازم است 23
1-3-2-1- آنزيم Bst پليمراز23
1-3-2-2- آنزيم phi29 DNA پليمراز: 24
1-3-2-3- پروب: 24
1-3-3- واکنش RCA: 26
1-3-3-1- مرحله هيبريد شدن: 26
1-3-3-2- مر حله اتصال(Ligation): 26
1-3-3-3- مراحل تکثير دايره اي چرخان: 26
1-3-3-4- مرحله تشخيص و بررسي محصول RCA27
فصل دوم: مروري بر مطالعات گذشته
2-1- پيشينه تحقيق در ضمينه تکنيک RCA 29
فصل سوم: مواد و روش کار
3-1- مواد و لوازم مورد نياز32
3-2- دستگاه هاي مورد نياز34
3-3- نوع پژوهش 35
3-4- جامعه پژوهش35
3-5- روش انجام پژوهش 35
3-5-1 استخراج DNA 35
3-5-2- تعيين بازدهي و کيفيت DNA استخراج شده37
3-5-3-PCR 37
3-5-3-1- اجزاء واکنش PCR : 39
3-5-3-2- پرايمرهاي مورد استفاده جهت PCR : 39
3-5-3-3- طراحي پرايمر PCR 39
3-5-3-4- دماي اتصال پرايمرها به DNA40
3-5-3-5- dNTP Mix : 40
3-5-3-6-MgCl2 :40
3-5-3-7- Reaction Buffer: 41
3-5-3-8- Taq DNA Polymerase: 41
3-6- روش انجام PCR : 41
3-6-1- مواد و وسايل لازم : 41
3-6-2- روش کار 41
3-6-3- نکاتي که بايد در هنگام انجام PCR بايد رعايت کرد :42
3-6-4- استفاده از کنترل مثبت ومنفي در کيفيت PCR43
3-6-5- الکتروفورز نمونه هاي PCR شده بر روي ژل آگارز43
3-6-6- مواد و وسايل مورد نياز براي الکترفورز ژل آگارز44
3-6-7- طرز تهيه بافر TBE 5X (يک ليتر) :45
3-6-8- روش تهيه ژل آگارز 45
3-6-9- روش نمونه گذاري روي ژل الکتروفورز46
3-7- انجام واکنش RCA 46
3-7-1- طراحي پروب اختصاصي: 46
3-7-2- تهيه پرايمر: 49
3-7-3- روش اجراي تستRCA: 50
فصل چهارم: نتايج
4-1- آزمون PCR54
4-2- آزمون RCA55
4-2-1- بهينه سازي دماي اتصال (Ligation): 55
4-2-2- بهينه سازي دماي RCA 55
4-2-3- بهينه سازي غلضت آنزيم Bst DNA پليمراز: 55
فصل پنجم: بحث، نتيجه گيري و پيشنهادات
5-1- بحث58
5-2- نتيجه گيري 62
5-3- پشنهادات63
منابع64
چکيده انگليسي………………………………………………………………………………………………………………………………69
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول-1-3- پرايمر هاي مورد استفاده، در تكثير ناحيه ITS rDNA39
جدول-2-3- مقادير لازم براي واکنش25 ميکروليتري PCR ناحيه ITS42
جدول-3-3- برنامه مراحل مختلف PCR42
جدول -4-3- مقادير لازم جهت ساخت TBE45
جدول -5-3- توالي نوکلئوتيدي ناحيه ITS1 از DNA ريبوزومي 48
جدول -6-3- توالي نوکلئوتيدي پروب طراحي شده براي گونه هاي قارچي بانتيانا و ساموفيلا 49
جدول-7-3- پرايمر هاي مورد استفاده در واكنش RCA 49
جدول -8-3- مقادير لازم براي 10 ميکروليتر واکنش Ligation50
جدول -9-3- برنامه دمايي مرحله Ligation51
جدول -10-3- مقادير لازم براي 20 ميکروليتر واکنش RCA 51
جدول -11-3- برنامه دمايي مرحله Amplification 52
جدول -1-5- مقايسه روشهاي ازدياد DNA در شرايط هم دمايي با PCR 60
فهرست نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار -1-1- در نمودار درخت فيلوژني رده کتوتيريالس که گونه هاي کلادوفيالوفورا را شامل مي گردد 16
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل-1-1- بررسي شكل ميكروسكوپي كندي هاي قارچي كلادو فيالوفورا بانتيانا و كلادوفيالوفورا ساموفيلا17
شكل -2-1- تصوير شماتيك از پروب طراحي شده براي كلادوفياالوفورا بانتيانا25
شكل-3-1- تصوير شماتيك طراحي شده مراحل انجام واكنش RCA27
شكل-1-3- تصوير سايت NCBI وSearch توالي ژني قارچ47
شكل-1-4- نتيجه واكنش PCR براي قارچ کلادوفيالوفورا بانتيانا و کلادوفيالوفورا ساموفيلا54
شكل-2-4- نتيجه واكنش RCA براي قارچ کلادوفيالوفورا بانتيانا و کلادوفيالوفورا ساموفيلا55
شكل-3-4- نتيجه واكنش RCA براي گونه هاي ديگرکلادوفيالوفورا 56
چکيده
پاتوژن هاي قارچي عوامل عفوني تهديد کننده زندگي براي بيماران بدحال و داراي نقص سيستم ايمني هستند. روند اپيدميولوژيک اخير نشان مي دهد تغييرات در گونه هاي قارچي بخصوص قارچ هاي سياه در جهت ايجاد گونه هاي پاتوژن نوظهور افزايش يافته است. با توجه به کاهش حساسيت بسياري از اين عوامل بيماري زا به داروهاي ضد قارچي، شناسايي به موقع در سطح گونه با توجه به سطح و گونه براي مديريت باليني ضروري است. با اين وجود روش هاي استاندارد تشخيصي انجام شده وقت گير، هزينه بر و از حساسيت کمي برخوردار مي باشند. براي فائق آمدن به مشکل هاي ذكر شده، ابزارهايي مبتني بر PCR1 توسعه يافته اند. در اين بررسي به طور اختصاصي از ناحيه رونويسي داخلي ITS 2 اختصاصا مناطق ITS1 و ITS2، از مجموعه ژني DNA هاي ريبوزومي قارچ جهت شناسايي به روش Rolling Circle [0]Amplification (RCA )3، به عنوان يک تکنيک مبتني بر پروب براي تشخيص گونه هاي قارچي كلادوفيالوفورا بانتيانا عامل بيماري فئوهايفومايکوزيس و كلادوفيالوفورا ساموفيلا استفاده گرديد. اين پروب در اصل توالي مكمل هدف منتهي به جايگاه لينكر مي باشدكه پس از هيبريداسيون با DNAي هدف توسط DNA ليگاز به هم ملحق شده و به شکل يک مولکول بسته در مي آيد و با اتصال به DNA و تکثير در شرايط تک دمايي مطالعات مورد ارزيابي قرارگرفت و در نتايج به دست آمده با ملاحظه باند هاي نردباني حاصل از الکتروفورز محصول RCA حاکي از انجام واکنش مذکور به طور اختصاصي براي جايگاه تعيين شده بر روي پروب و در کمترين زمان نسبت به روش هاي ديگر بود.
نتايج نشان دهنده قدرت و دقت اين تکنيک در شناسايي عوامل بيماري زاي قارچي در حد گونه با سرعت و اختصاصيت بسيار بالا در مقايسه با روش هاي شناسايي قديمي مي باشد و اين تکنيک مي تواند کابرد فراواني در کليه آزمايشگاه هاي تشخيصي داشته باشد.
واژه هاي كليدي: تكثير دايره اي چرخان4، كلادوفيالوفورا بانتيانا 5، كلادوفيالوفورا ساموفيلا 6، فئوهايفومايكوزيس7.
مقدمه
امروزه با افزايش کيفيت استانداردهاي بهداشتي لزوم به پيشگيري و نهايتا درمان سريع بيماري ها اجتناب ناپذير مي باشد. لذا در اين راستا يکي از ابزار هاي مهم در اين مقوله تشخيص به موقع و دقيق مي باشدکه يکي از عوامل اصلي کنترل کيفي در کليه زمينه هاي بهداشتي و درماني است. با پيشرفت هاي انجام شده در علم ژنتيک راه کارهايي در پيش روي محققين قرارگرفته است که توسط آن توانسته اند قدم هاي بسيار بلندي در امر تسريع کنترل کيفي و تشخيص بيماري ها بردارند. يکي از تحولات عظيم در بحث ژنتيک و به طبع آن تشخيص طبي، اختراع روش واکنش زنجيره اي پليمراز مي باشد.
اين تکنيک علاوه بر کمک به اجراي پروژه تعيين توالي موجودات بخصوص انسان در بسياري از علوم کاربرد پيدا کرده است از جمله ايجاد موجودات تراريخت، کمک به درمان بيماري هاي مختلف، توليد محصولات صنعتي و دارويي، و از همه مهمتر افزايش دقت و سرعت در بررسي و آزمايش هاي تشخيصي بوده است.
با اين وجود به اين تکنيک نيز اشکالاتي وارد بوده که از آن جمله مي توان نياز واکنش زنجيره اي پليمراز به دستگاه گران قيمت ترمال سايکلر 8و همچنين وقت گير بودن و نيز احتمال آلودگي و ايجاد واکنش هاي ناخواسته اشاره کرد که هر کدام محدوديت هايي را در پيش پاي متخصصين قرار داده است.
خوشبختانه با ايجاد پايگاه داده هاي ژني (Gene Bank) و پروتئيني محققين به روش هايي دست يافته اند که به کمک علم نوپاي بيوآنفورماتيک ميتوان روش هاي بسيار دقيق تر، اختصاصي تر و سريع تر از تکنيک هاي متداول موجود در علوم تشخيصي ارائه نمود(8،9).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

در اين پروژه سعي شده علاوه بر بررسي تکنيک هاي جديد مولکولي که به تازگي توسط محققين جهت رفع يکي از نواقص ذکر شده براي واکنش هاي زنجيره اي پليمراز به مطالعه آن ها پرداخته اند ، با انتخاب دو واريته از جنس کلادوفيالوفورا که هردو از لحاظ فنوتيپکي بسيار مشابه هم بوده و از نظر فيلوژني و تاکسونومي به عنوان دو سويه خواهري طبقه بندي شده است به امکان سنجي عملي و بررسي کاربرد تکنيک تکثير دايره اي چرخان به تشخيص دوگونه قارچي پرداخته شود.
يکي از اين گونه ها، کلادوفيالوفورا بانتيانا مي باشد که جزء قارچهاي سياه بيماري زا بوده و ديگري کلادوفيالوفورا ساموفيلا مي باشد که در دهه اخير كشف و از طبيعت جداسازي شده و بيماري زايي آن هنوز به اثبات نرسيده است.
در اين روش پيش از پرداختن به واکنش بايد با استفاده از پايگاه داده هاي ژني توالي اختصاصي گونه مورد نظر را يافت و از اختصاصي بودن آن اطمينان حاصل نمود و در نهايت با طراحي يک پروب اختصاصي نسبت به بهينه سازي انجام واکنش اقدام کرد.
براي بررسي دقت اين تکنيک سعي شده از گونه هايي براي تشخيص استفاده کرد که تشخيص آن ها از طريق روش هاي [0]معمول مورد استفاده در آزمايشگاههاي قارچ شناسي بسيار دشوار باشد.
1-1- بخش اول : کلياتي در خصوص فئوهايفومايکوزيس و عوامل آن
1-1-1- مقدمه
قارچ هاي سياه به صورت گندروي بر روي مواد گياهي زنده يا مرده ساکن هستند اما بيشتر آنها ساکن خاک مي باشند. بيش از 150 گونه و 70 جنس از قارچ هاي سياه در بيماري هاي انسان و حيوان دخالت دارند سندرم هاي باليني متنوعي توسط قارچ هاي سياه براساس يافته هاي بافت شناختي ايجاد مي شوند که شامل کروموبلاستومايکوزيس،فئوهايفومايستوما و فئوهايفومايکوزيس مي باشند.
فئوهايفومايکوزيس به بيماري هاي ايجاد شده توسط قارچ هاي تيره از جنس هاي مختلف اطلاق مي شود که شامل: بيماري آلرژيک، عفونت سطحي، عفونت موضعي عمقي، عفونت ريوي،عفونت سيستم عصبي مرکزي و عفونت منتشره ميباشند. عفونت سيستم عصبي مرکزي به عنوان فرم کشنده فئوهايفومايکوزيس در افراد با ايمني سالم به شمار مي رود. مهم ترين قارچ هاي سياه داراي اهميت پزشکي، در راسته کتوتريال ها قرار دارند مثل گونه هاي اگزوفيالا، گونه هاي کلادوفيالوفورا و گونه هاي رينوکلاديلا . روش هاي استاندارد و رايج جهت تشخيص شامل : آزمايش ميکروسکوپي مستقيم، رنگ آميزي هاي هسيتوپاتولوژي جهت اثبات تهاجم بافتي،يافته هاي راديوگرافي و سي تي اسکن مي باشد. اخيراً براي تشخيص سريع تر عفونت هاي قارچي تهاجمي با حساسيت و اختصاصيت بالا ، روش هاي مولکولي بر پايه PCR توصيه شده است . درمان بسياري از اين عفونت ها با استفاده از داروهاي تري آزول جديد مثل وريکونازول که بيشترين فعاليت in vitro عليه اين قارچ ها را دارند انجام مي گيرد.
قارچ هاي تيره يا سياه به طور گسترده اي در طبيعت پراکنده اند و گاهي مي توانند در انسان ايجاد عفونت کنند. اين قارچ ها داراي ويرولانس نسبتاً پاييني مي باشند و طيف وسيعي از بيماري هاي را که ايجاد
مي کنند به فاکتورهاي ميزبان وابسته است . عفونت هايي که توسط اين قار چ ها ايجاد مي شود عبارتند از: فئوهايفومايستوما با گرانول سياه رنگ، کروموبلاستومايکوزيس، سينوزيت و فئوهايفومايکوزيس هاي سطحي، جلدي، زير جلدي و سيستميک. فئو، يک کلمه يوناني به معني تيره مي باشد و عفونت هاي حاصل از قارچ هاي با ديواره تيره را فئوهايفومايکوزيس گويند عبارت هاي دماتياسئوس ، فائوئيد ، تيره و ملانيزه ، به طور متناوب به جاي يکديگر به کار مي روند قارچ هاي تيره به طور عادي در محيط حضور دارند و اغلب از آزمايشگاه هاي ميکروب شناسي به عنوان آلوده کننده محيط جدا مي شوند . در حقيقت فقط 10 درصد از ايزوله هاي قارچي سياه در آزمايشگاه با ايزوله هاي مهم باليني مشابهند . بيماري هاي باليني ايجاد شده توسط اين قارچ غير معمول است و به طور تخميني در يک شهر بزرگ 1000000/1 مورد در سال مي باشد. با وجود اين قارچ هاي تيره به طور فزاينده اي به عنوان پاتوژن هاي مهم به ويژه در بيماران با ضعف سيستم ايمني شناخته مي شوند، اگر چه در افراد به ظاهر سالم سيستم ايمني نيز گزارشاتي از عفونت هاي تهاجمي و اغلب کشنده در دست است، سندرم هاي باليني که توسط اين قارچ ها ايجاد شده است از طريق يافته هاي بافت شناختي در فئوهايفومايستوما، کروموبلاستومايکوزيس و فئوهايفومايکوزيس تمايز داده مي شوند. فئوهايفومايکوزيس عبارت کلي است که براي سندرم هاي باليني ايجاد شده توسط قارچ هاي تيره به کار رفته است .
قارچ هاي سياه يا تيره به طور متناوب به صورت گندروي بر روي مواد آلي در حال فساد يا مواد گياهي زنده يا مرده ساکن هستند اما بيشتر آن ها ساکن خاک مي باشند. شناسايي عوامل اتيولوژيک که باعث ايجاد بيماري در انسان و حيوان مي شوند طبق روش هاي سنتي از طريق ويژگي هاي فنوتيپيک ايزوله هاي جدا شده ا ز کشت مي باشد. اخيراً ، بيشتر روش هاي مولکولي براي تقسيم بندي از نظر فيلوژني و تاکسونومي اين قارچ ها به کار گرفته شده است و اين باعث مي شود که تحقيقات بر روي آن ها آسانتر صورت گيرد. تشخيص فنوتيپيک قارچ هاي سياه براساس روش هاي ريخت شناسي ما کروسکوپي )رنگ کلني، ميزان رشد و مشخصه رشد روي محيط استاندارد) و ريخت شناسي ميکروسکوپي (هايفا، سلول هاي کونيدي زا و کونيدي غيرجنسي و … ) و همچنين تعدادي ويژگي هاي فيزيولوژيک انجام مي گيرد. اين روش ها جهت شناسايي قارچ در حد جنس براي ما کاربرد دارد.(1،2،4)
1-1-1-1-مشخصات ريز بيني
ساختمان هاي مختلفي که در ريزبيني اين قارچ ها وجود دارد به خاصيت چند شکل بودن آن ها برمي گردد . بعضي از اين قارچ ها ممکن است که در ابتداي رشد به فرم شبه مخمري سياه باشند اما در ادامه به فرم رشته اي رشد مي کنند اين خصوصيت بيشتر در اگزوفيالا و جنس هاي وابسته به آن ديده مي شود اکثر قارچ هاي سياه باليني، آسکومايست هاي هتروتاليک مي باشند. روش هاي کونيدي زايي به صورت هاي بلاستيک )توليد بلاستوکنيدي هاي قهوه اي رنگ) که دراکثر جنس ها ديده مي شود و يا تاليک که تشکيل شده از هايفايي که از قبل وجود دارد و يا آرتروکونيدي ها مثل نئوسيتاليديوم مي باشد. سلول هاي کونيديزاي نوع بلاستيک(انتروبلاستيک(به دو صورت آنليديک مثل هورتا و اگزوفيالا و فياليديک مثل فيالوفورا (در بسياري از جنس ها) مي باشند . اين ويژگي هاي مورفولوژيک بيشتر براي شناسايي گونه هاي آنامورف استفاده مي شود در حالي که براي تلئومورف نمي توان از اين طريق جايگاه فيلوژني تعيين کرد .(2،4،6)
1-1-1-2-ويژگيهاي فيزيولوژيک
مشخصات فيزيولوژيک نيز ممکن است براي جداسازي جنس و گونه هاي مختلف کمک کننده باشد . مواردي مثل توانايي يا عدم توانايي ايزوله ها در رشد روي محيط حاوي سيکلوهگزاميد(مقاومت به سيکلوهگزاميد)،جذب و تخمير قندها ،جذب نيترات،جذب ترکيبات منو آروماتيکي، فعاليت اوره آز،مقاومت به نمک به ويژه براي استرين هاي نمک دوست مي توانند در کنار آزمايشات مورفولوژيک کمک کننده باشند. مقاومت به حرارت نيز براي جداسازي پاتوژن هاي بالقوه مي تواند مفيد باشد . بعضي از کپک هاي سياه که از نظر باليني اهميت دارند به حرارت مقاومند و در حرارت 45°c يا بيشتر نيز رشد مي کنند . بعضي از اين قارچ ها مثل: اگزوفيالا درماتيتيديس، کلادوفيالوفورا بانتيانا، رينوکلاديلا ماکنزي، اُکروکونيس گالوپاوا، آکروفيالوفورا فوزيسپورا و فونسکا مونوفورا، گونه هاي نوروتروپيک هستند و به سيستم عصبي علاقه مندند . (2،4،6)
1-1-1-3-ويژگي هاي مولکولي
شناسايي مولکولي اکثر گونه ها متکي بر تعيين توالي ژن هاي ريبوزومال و مقايسه آن ها با پايگاه داده هاي منتشر شده مي باشد مثل بانک ژني، هر چند که بيش از 10 درصد اين داده ها ممکن است نادرست باشد. پايگاه داده هاي اختصاصي همچنين گاهي اوقات براي جنس هاي به خصوص مورد استفاده قرار مي گيرد هر چند که دسترسي به اين ها مشکل است ممکن است حتي شامل داده هاي نادرِستي که در آن جا ذخيره شده، باشد. حتي ژن ها و نواحي ژني مختلفي مثل (ITS1-5.8S-ITS2) ITS rDNA و حيطه D1/D2 ، بتا- توبولين، آکتين، کالمودولين، منگنز سوپر اکسيد ديسموتاز ، ATPase زير واحد 6، کيتين سنتاز، زير واحد کوچک ميتوکندريال(ssu) RNA ، فاکتور افزا يش دهنده ترجمه 1 آلفا و موارد ديگر مورد استفاده قرار مي گيرد.
1-1-1-4-پاتوژنژ
اسپورهاي قارچ هاي سياه به فراواني در هواي محيط بيرون پخش هستند. بنابراين همه افراد به نحوي در تماس با اين اسپورها مي باشند ولي با وجود اين موارد بيماري هاي ايجاد شده توسط اين قارچ ها کم مي باشد. معمولاً اولين تماس از طريق استنشاق يا تروماي کوچک مي باشد که حتي تماس مکرر نيز ممکن است جهت ايجاد بيماري نياز نباشد . دانسته ها در مورد مکانيسم هاي بيماريزايي توسط قارچ هاي سياه به ويژه در افراد سالم نسبتاً کم است.
1-1-1-5-فاکتورهاي ويرولانس
زيستگاه طبيعي اين قارچ ها مواد گياهي در حال فساد و مرده، چوب، فيلترهاي زيستي، خاک هاي آلوده به هيدروکروبن هاي سمي، سطوح بي جان، صخره و بافت هاي پستانداران محل زندگي آن هاست . همچنين شرايط بومي (اکولوژيکي (مثل افزايش دما، فشار اسمزي و وضعيت اکسيژن نيز تأثيرگذار است. مقاومت به استرس، سازگاري هاي ريخت شناختي، کپسول ها، مقاومت به حرارت، مقاومت به خشکي، و فيزيولوژي مثل آن هايي که ترکيبات مونوآروماتيک را تخريب مي کنند. باتوجه به وجود ملانين افزايش پيدا کرده است . بنابراين ملانين احتمالاً يکي از فاکتورهاي ويرولانس در ديواره سلولي اين قارچ هاست. ملانين ترکيبي است که در اکثر ميکروب ها و حيوانات وجود دارد . ساختمان منحصر به فرد آن باعث شده که نسبت به بسياري از مخرب هاي فيزيکي و شيميايي مقاومت و پايداري نشان دهد قارچ هاي سياه فقط حاوي ملانين دي هيدروکسي نفتالن مي باشند. ملانين به شدت نسبت به عوامل فيزيکي و شيميايي مختلف مقاوم است، مثل ترکيبات راديکال آزاد، فلزهاي سمي، خشکي و حتي تابش هاي يونيزه کننده. (2،4،6)
1-1-1-6-سندرم هاي باليني
سندرم هاي باليني متنوع و گسترده اي توسط قارچ هاي سياه ايجاد مي شود که همگي به طبيعت متنوع آن ها بر مي گردد. تعداد م قالات چاپ شده در مورد اين قارچ ها در سال هاي اخير افزايش پيدا کرده است . بيماري هاي ايجاد شده توسط اين قارچ ها عبارتند از : فئوهايفومايستوما Phaeohyphomycetoma يک عفونت مزمن زير جلدي است و از علاي م مشخصه اين بيماري وجود گرانول ها در بافت است .اين گرانول ها به رنگ تيره مي باشند و ترکيبي از سلول هاي قارچي احاطه شده توسط يک ماتريکس داخل سلولي فشرده شامل ملانين که باعث مي شود رنگ آن تيره شود، و احتمالاً در حفاظت ارگانيسم عليه ميزبان نقش ايفا مي کند. مادورلا مايستوماتيس يکي از بيشترين گونه هاي ايجاد کننده اين بيماري به خصوص در هندوستان و آفريقا مي باشد، گونه هايي ديگر ايجادکننده اين بيماري، پايرونکتا رومروئي در جنوب آفريقا، لپتوسفريا سنگالنسيس در آفريقا، اگزوفيالا جنسلمي، گونه هاي کوروولاريا و فيالوفورا وروکوزا مي باشند.
1-1-1-7کروموبلاستومايکوزيس Chromoblastomycosis
اين بيماري نيز يکي از عفونت هاي قارچي زير جلدي مزمن در مناطق گرمسيري مي باشد که به آهستگي پيشرفت مي کند و از علايم مشخصه اين بيماري وجود اجسام اسکلروتيک در بافت است. بيشترين عامل ايجاد کننده اين بيماري گونه فونسکاپدروزويي مي باشد (نواحي مرطوب و گرمسيري مثل برزيل) و بعد از آن فيالوفورا وروکوزا و به ميزان کمتر کلادوفيالوفورا کاريوني و رينوکلاديلا آکوسپرسا مي باشند (نواحي خشک و نيمه خشک مثل ونزوئلا). (2،4،6)
1-1-1-8-فئوهايفومايکوزيس Phaeohyphomycosis
سندرم هاي باليني قارچ هاي سياه همگي مي توانند تحت عبارت فئوهايفومايکوزيس مطرح مي شوند و شامل موارد زير است : بيماري آلرژيک، عفونت سطحي، عفونت موضعي عمقي، عفونت ريوي، عفونت سيستم عصبي مرکزي و عفونت منتشره.(4،6)
1-1-2- تاريخچه
1-1-2-1-فئوهايفومايکوزيس رينوسربرال در ايران
در سال 1999 ، رسولي نژاد و همکاران يک مورد فئوهايفومايکوزيس در يک پسر 16 ساله با ضايعات نازوفارنژيال و برآمدگي هاي گردني زير جلدي گزارش کردند. پس از آزمايش مستقيم و کشت عامل بيماري فيالوفورا وروکوزا شناسايي کردند . بيمار با ايتراکونازول خوراکي پس از 4 ماه درمان شد اما پس از 8 ماه عود مجدد داشت که دوباره ايتراکونازول براي مدت طولاني استفاده شد.
در سال 2002 ، جهرمي و همکاران يک مورد فئوهايفومايکوزيس رينوسربرال از يک پسر 18 ساله با گرانولوماتوز وجنر گزارش کردند. پس از آزمايش مستقيم و هيستوپاتولوژي و کشت عامل بيماري کلادوسپوريوم بانتيانوم به عنوان اولين مورد در ايران شناسايي کردند . بيمار با جراحي و آمفوتريسين ب درمان شد.
در سال 2003 ، صابري و همکاران يک مورد فئوهايفومايکوزيس رينوسربرال در يک پسر 18 ساله که ابتدا ضايعه جلدي در روي سينه داشته و با پيشرفت ضايعه لنفادنوپاتي گردن و درگيري سينوس اتموئيد و نازوفارنکس گزارش کردند پس از آزمايش مستقيم هيستوپاتولوژي و کشت عامل بيماري فونسکا پدروزوئي شناسايي شد . بيمار با جراحي و آمفوتريسين ب تزريقي و ايتراکونازول درمان شد.
در سال 2004 ، گرامي و همکاران اولين مورد فئوهايفومايکوزيس رينوسربرال به علت ناترازيا ما نجيفرا در يک پسر 17 ساله با سابقه لوپوس اريتماتوس گزارش کردند .در آزمايش مستقيم و هيستوپاتولوژي و کشت عامل بيماري را شناسايي کردند . بيمار پس از عدم پاسخ به درمان با آمفوتريسين ب فوت کرد.(4)
ترا و همکاران در سال 1922 با آزمايشات انجام شده علت زگيل هاي بيماري را ناشي از پيگمان هاي قارچي گزارش دادند (11،4).
اولين مورد بيماري در خارج از قاره آمريکا در سال 1927 در انستيتو پاستور الجزاير مشاهده گرديد و چندي بعد در طي چهار سال بيش از 129 مورد از سال 1937 ديده شد که در ماداگاسکارثبت گرديده است. در سال 1937 وروکوزا يکي ازعوامل بيماري را از خاک و طبيعت جدا کرد و آن را فيالوفورا وروکوزا نامگذاري کرد (11).
در طي تاريخ نام هاي مختلف روي اين بيماري و عوامل آن گزارش شده است. از جمله نام هاي مختلف بيان شده براي اين بيماري مي توان به بلاستومايکوزيس سياه و سفيد، درماتيت وروکوزا ،کرومومايکوتيک، کرومومايکوزيس، درماتيت زگيل، بلا ستو مايکوتيک، بيماري پدروسو و فونسکا امروزه اغلب به عنوان کرومومايکوزيس يا کروموبلاستومايکوزيس ، شناخته مي شود(8،4).
از نظر باليني شامل چندين گونه بيماري زا مي باشد که عبارتند از گونه هاي مودستا (Modesta)و بانتيانا که باعث عفونت مغز مي گردد، گونه هاي دوريسي و آکزي باعث انعقاد عروق منتشره مي شود و گونه هاي بوپي، امونسي و ساچورنيکا باعث عفونت پوست مي شود(17،15،4،3).
1-1-3- کلادوفيالوفورا بانتيانا C. bantiana))
کلادوفيالوفورا قارچي است از جنس قارچ هاي شبه مخمري سياه متشکل از تعدادي گونه هاي کلينيکي مهم و سويه هاي محيطي قابل توجه تشکيل شده است(1-3).
نام قديمي آن کلادوسپوريوم بانتيانا بوده که جديدا براي اين جنس نام کلادفيالوفورا بانتيانا در نظر گرفته شده است.اولين توصيف قارچ توسط بينفورد در سال 1952 صورت پذيرفت و آمونس نيز آن را کلادوسپوريوم تريکوئيدس ناميد.ولي چون به عقيده بسياري از محققين ،مشخصات قارچ با نمونه اي که سالها پيش براي اولين بار توسط بانتي از يک بيماري مغزي جدا شده بود،مطابقت داشت ، آن را کلادوسپوريوم بانتيانا نامگذاري نمودند. اين قارچ اغلب باعث ايجاد عفونت در انسان مي شود و باعث بوجود آمدن ضايعات پوستي خفيف تا آنسفاليت کشنده مي گردد. اين اورگانيسم به طور شايع از موارد فئوهايفومايکوزيس مغزي جدا مي شود. اين قارچ همچنين مي تواند عامل بيماري کروموبلاستومايکوزيس ، سيستهاي فائومايکوتيک باشد.تمايل اين قارچ به بافتهاي مغزي زياد بوده و نه تنها در انسان بلکه آن را از ضايعات مغزي گربه نيز گزارش شده است.در مواردي آن را از عفونتهاي پوستي و بخصوص از پا ، جدا نموده اند.(1،4،6)
اين قارچ داراي رشد نسبتاً سريع بوده، ايجاد کلني پخش شونده و کمي چين خورده به رنگ زيتوني خاکستري تا زيتوني قهوه اي را مي نمايد.

کونيديوفورها طويل، قهوه اي و با تيغه مياني مي باشند. کونيدياها به صورت زنجيره هاي طويل، شاخه شاخه و پر پيچ وخم بوده و گرچه اندازه اغلب آنها 7-4×3-2 ميکرون مي باشد ولي بعضي ها ممکن است به اندازه 15×30-15ميکرون هم برسند.اعتقاد پاره اي برآن مي باشد که تنها با استناد بر مشخصات ظاهري کلني و شکل ريز بيني آن نمي توان کلادوفيالوفورا بانتيانا را تفکيک نمود، بلکه بايد با استفاده از خواصي همچون ، تمايل به بافت عصبي (که توسط عفونت تجربي در حيوانات آزمايشگاهي مشخص مي شود)، قابليت رشد در °C43، عدم توانايي حل کردن ژلاتين و توليد زنجيره هاي کونيدياي متشکل از 35 کونيدي و يا بيشتر ، آن را از ديگر گونه هاي کلادوفيالوفورا تفکيک نمود.در عين حال عده اي بر اين باور هستند که خصوصيات ساختماني کلادوفيالوفورا بانتيانا چنان مشخص و اختصاصي است که به راحتي از گونه هاي ديگر تشخيص داده مي شود.
قضاوت اينکه اين جنس نشات گرفته از کدام رده از آسکوميست ها مي باشد با بررسي توالي نوکلئوتيدي در ناحيه ژني SSU rDNA انجام شد. نتيجه آن تشخيص اطلاعات نژادي اين جنس بود که متعلق به آسکوميستها و در رده کتوتيريال ها طبقه بندي شد وجنس آنها مربوط به کاپرونيا مي باشد(1-4).
1-1-4- فئوهايفومايکوزيس
فئوهايفومايکوزيس، واژه ي کلينيکي مي باشد که نخستين بار توسط آيلو( (Ajelloبه کار رفته و در برگيرنده عفونتهاي منتشره مختلفي است که به وسيله قارچهاي سياه ايجاد مي شود. عناصر قارچي در آزمايش مستقيم و عمدتاً در مقاطع بافتي، به صورت ميسليومي و به رنگ سياه مشاهده مي گردند. در کشت از ضايعه نيز رنگ کلني هاي عامل بيماري ، سياه و به عبارت بهتر تيره رنگ مي باشد.
به علت فقدان گرانول يا کلني هاي توده مانند قارچي در ضايعات ،از مايستوماهاي قارچي و به دليل عدم مشاهده اجسام اسکلروتيک ، از کروموبلاستومايکوزيس مستقل مي گردد، هر چند که عوامل بيماري هاي فوق را نيز قارچهاي سياه و احتمالاً مشترکي تشکيل مي دهند. انتقال بيماري ممکن است از طريق خاک غارها و معادن صورت پذيرد ولي چون عوامل اين دسته بيماري ها در مقاطع بافتي ، بصورت ميسليوم تيره رنگ مشاهده مي شوند هيچ گاه با هيستوپلاسما اشتباه نخواهند شد.
1-1-4-1- ميزان پراکندگي جغرافيايي بيماري فئوهايفومايکوزيس
بيماري انتشار جهاني دارد ولي در نواحي گرمسيري و نيمه گرمسيري شايع تر است. بيماري در امريکاي شمالي و مرکزي شيوع بالايي دارد، همچنين در جنوب افريقا، آسيا و استراليا نيز مشاهده مي شود. بيشتر گزارشات بيماري مربوط به برزيل، کاستاريکا و ماداگاسکار مي باشد (2،4،6).
1-1-4-2- عوامل بيماري فئوهايفومايکوزيس
فئوهايفومايکوزيس توسط طيف وسيعي از قارچهاي سياه ايجاد مي شود که مهمترين آنها عبارتند از:
فيالوفورا وروکوزا Phialophora verecosa ، فونسکا پدروزي Fonsecaea pedrosoi،
درکسلرا derecerela ، فونسکا مونوفورا F. monophora ، کلادوفيالوفورا بانتيانا
Cladophialophora bantiana ، آلترناريا Alternaria ، کوروولاريا Curvularia ،


پاسخ دهید