ضديخ هاي نفوذپذير بواسطه ي خاصيت آبدوستي بالاي خود، با ملکول هاي آب موجود در محيط کشت ميانکنش مي دهند، اين ميانکنش موجب افزايش نفوذ ضديخ به داخل سلول مي شود. وجود ضديخ در فضاي داخل سلول باعث بالا رفتن ويسکوزيته ي مايع درون سلول و کاهش دماي لازم براي تشکيل کريستال يخ در داخل سلول ميگردد، بنابراين استفاده از غلظتهاي بالاي ضديخ، باعث افزايش ويسکوزيته ي داخل سلول، جلوگيري از تشکيل و تجمع هسته هاي يخي و در نتيجه جلوگيري از آسيب غشايي مي شود. خروج آب در حين فرآيند آبگيري از داخل سلول، باعث چروکيدگي سلول و افزايش غلظت نمک ها در داخل سلول مي شود که مي تواند اثرات نامطلوبي بر سلول اعمال نمايد. نفوذ ضديخ به داخل سلول، با رقيق سازي مواد موجود در سلول، سبب جلوگيري از اثرات نامطلوب ناشي از ميانکنش هاي مضر ميان ترکيبات مختلف داخل سلول مي گردد (28).
ب: عملکرد ضديخ هاي نفوذ ناپذير

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

ضد يخ هاي نفوذ ناپذير مانند ترهالوز و سوکروز با وجود وزن مولکولي بالا نمي توانند به داخل سلول نفود کنند و با افزايش اسمولاريته در محيط اطراف سلول به فرآيند آبگيري کمک کرده و همچنين با افزايش ويسکوزيته ي محيط کشت باعث کاهش دماي تشکيل کريستال يخ در حين انجماد مي شوند (24, 28).
ج: عملکرد مشترک ضديخ هاي نفوذ پذير و ضد يخ هاي نفوذ ناپذير

از جمله ديگر ويژگي هاي ضد يخ ها مي توان حفظ سلامت غشاي دو لايه ي سلول و پروتئين هاي سلولي را نام برد. در اين مورد ضد يخ هاي نفوذ پذير مانند DMSO و ضد يخ هاي نفوذ ناپذير مانند سوکروز ايفاي نقش مي کنند، اين ضد يخ ها با پيوند هاي الکتروستاتيکي که با فسفوليپيد هاي غشا ايجاد مي کنند، باعث حفظ پايداري غشا سلولي مي شوند (26).
1-2-3-2-سرم
سرم در محيط پايه براي حفظ سلول ها، بافت و کاهش اثرات مخرب ضديخ ها مورد استفاده قرار مي گيرد. در گذشته محققان بر اين باور بودند که وجود سرم در محيط انجمادي سلول يا بافت، مانند سلول هاي اسپرماتوگوني (14, 29)، بافت تخمدان (30) و بافت بيضه (31-33) اثرات مثبتي در حفظ نمونه ي انجمادي دارد. در همهي اين تحقيقات ميزان سرم مصرفي 5% تا 20% گزارش شده است. با اين حال پژوهشي که در سال 2013 انجام شد، نشان داد که، افزايش غلظت سرم در محيط انجمادي باعث افزايش بقاي سلولي نمي شود. بنابراين مي توان با کاهش ميزان سرم در محيط انجمادي هزينه هاي مصرفي روش هاي انجمادي را تا حدودي کاهش داد (34).
1-2-4-تاثيرات انجماد بر بافت بيضه
از آنجاييکه انجماد بافت بيضه گزينه ي مهمي در حفظ باروري پسران نابالغ مبتلا به سرطان است، دستيابي به مطلوبترين روش جهت حفظ بافت بيضه بسيار پراهميت است. روش هاي انجمادي بر تماميت بافت بيضه، حفظ و تکثير سلولهاي اسپرماتوگوني، عملکرد سلولهاي محافظت کننده (سرتولي) و بقاي سلول ها تاثير گذارند، از اين رو محققان در راستاي ارزيابي اين اثرات بر بافت بيضه تحقيقات مختلفي را انجام داده اند. Millazo و همکاران با ارزيابي روش هاي مختلف انجمادي، تکنيک انجماد آهسته بوسيله ي ضد يخ DMSO را نه تنها به عنوان تکنيکي موثر براي حفظ ساختار بيضه، بلکه براي حفظ عملکرد بيضه نيز پيشنهاد کردند (33). در سال 2011 آزمايشي در راستاي بررسي اثرات عوامل دخيل در انجماد بافت بيضه انجام شد، اين گروه با بررسي عوامل مختلف دخيل در انجماد (مانند اندازه بافت، نوع ضد يخ، غلظت ضد يخ و…) روش انجمادي مطلوبي را جهت انجماد بافت بيضه رت پيشنهاد کردند. اين گروه بهترين حالت انجماد بافت بيضه را، انجماد بافت بيضه ي5/7 mg موش صحرايي با غلظت 5/1 مولار DMSO پيشنهاد کردند (35). بدنبال آن در سال 2012 ارزيابي هايي که به منظور بررسي تاثيرات سن، حالت نمونه (به شکل بافت و يا سوسپانسيون سلولي) و غلظت ضد يخ مورد استفاده انجام شد حاکي از آن بود که بافت بيضه ي نابالغ در مقايسه با بافت بيضه ي بالغ نسبت به ضد يخ ها حساس تر بوده و انجماد بيضه به صورت بافت، مطلوبتر از انجماد آن به صورت سوسپانسيون سلولي است، چرا که زنده ماني سلولها در انجماد بافت بالاتر از انجماد سوسپانسيون سلولي است. اين تحقيق نيز DMSO را به عنوان ضديخ مناسب براي انجماد بافت بيضه نابالغ وEG را به عنوان ضد يخ مناسب براي انجماد بافت بيضه ي بالغ در انسان پيشنهاد کرد (36). تا به امروز مطالعات مختلفي به منظور مقايسه ي روش هاي انجمادي مختلف انجام شده است، به طوري که در سال 2011 آزمايشي طراحي و انجام شد که در آن 3 روش انجمادي با يکديگر مقايسه شده بودند، علاوه بر آن اثر حالات مختلف بافت بيضه (از لحاظ وجود، عدم وجود و دستکاري تونيکا آلبوجينا و نحوه ي برش بافت) در نتيجه ي انجماد نيز مورد بررسي قرار گرفت. به طوريکه بافت بيضه در 4 حالت، بدون تونيکا، بافت بيضه با تونيکاي دستکاري شده (ايجاد منافذي در تونيکا آلبوجينا به وسيله ي سوزن به منظور نفوذ پذير ساختن بافت جهت نفوذ ضديخ)، با تونيکاي سالم و بافت بيضه اي که به صورت طولي برش خورده بود، تحت انجماد واقع شدند و نتايج نشان داد زمانيکه بيضه بصورت طولي برش مي خورد و يا با سوزن دستکاري مي گردد، ميزان زنده ماني سلولها در مقايسه با دو حالت ديگر بسيار بالاتر است. از طرفي روش انجماد شيشه اي به عنوان روشي بهينه در زمان و هزينه براي حفظ بافت بيضه و سلولهاي اسپرماتوگوني مطرح شد (37). در سال 2012 Baert و همکاران آزمايشي انجام دادند که در آن نرخ موفقيت پس از انجماد شيشه اي و انجماد آهسته در يک سطح نشان دادند، به گونه اي که پس از انجماد شيشه اي فراساختار سلولهاي اسپرماتوگوني، مورفولوژي توبولهاي بيضه اي و عملکرد بافت بيضه اي به خوبي حفظ شده بود (38). اين مطالعات مستنداتي را ارائه کرد که نشان داد تکنيک انجماد شيشه اي روشي ساده، ارزان و مطلوب بوده و مي تواند به عنوان روشي کارآمد جهت حفظ بافت بيضه استفاده شود. Poels و همکاران نيز در سال 2012 با مطالعه اي که در مورد انجماد شيشه اي بافت بيضه و پيوند آن انجام دادند، اعلام کردند که تکثير سلولهاي اسپرماتوگوني و عملکرد سلولهاي لايديگ پس از انجماد شيشه اي و پيوند بافت حفظ مي شود (39). امروزه براي بازيابي باروري پس از انجماد بافت بيضه سه روش آزمايشگاهي: پيوند بافت بيضه ي منجمد شده، کشت و بلوغ آزمايشگاهي بافت بيضه و استخراج، کشت و تمايز سلولهاي اسپرماتوگوني مطرح است.
3-1-3-پيوند
مطالعات in Vivo پس از انجماد بافت بيضه نتايج اميدوار کننده اي را در پي داشت. در انسان پيوند زنوگرفت بافت بيضه ي منجمد شده با روش انجماد آهسته به موش nude پس از شش ماه، حفظ قدرت تکثير و تمايز سلولي را در بافت بيضه ي منجمد و ذوب شده نشان داد. علاوه بر آن، تماميت لوله هاي سمي نفروس در نمونه هاي کنترل، انجماد آهسته و انجماد شيشه اي پيوند شده، به خوبي نمونه هاي تازه ي پيوند نشده حفظ شده بود (40). تنها نقطه ضعف اين مطالعه کاهش چشمگير تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني در نمونه هاي انجمادي (آهسته و شيشه اي) و نمونه هاي کنترل پيوند شده بود (40) که آنرا مي توان به نقص در فرآيند پيوند نسبت داد. به نظر مي رسد آنچه سبب کاهش تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني پس از پيوند مي گردد تاخير در خون رساني مجدد بافت پيوندي و آپوپتوز سلول ها باشد(41). آپوپتوز فرايندي است که در مراحل ابتدايي پيوند حادث مي شود به صورتي که در سه روزه ي اول پيوند ميزان آپوپتوز در بافت بالا رفته (21) و بتدريج و تا هفتهي سوم ميزان آن کاهش چشم گيري مي يابد (22) و تا ماه ششم نيز روند کاهش آپوپتوز ادامه مي يابد (21). ايسکمي بافت مي تواند باعث آسيب به سلولهاي اسپرماتوگوني، سلولهاي سرتولي، سلولهاي ميوييد، تخريب سيستم خونرساني داخل بافت بيضه و غيره شود که همگي لازمه ي حفظ کنام سلولهاي اسپرماتوگوني هستند (42, 43) در راستاي بررسي حفظ عملکرد سلول هاي موجود در بيضه، Abrishami و همکاران با مطالعه ي انجماد بافت بيضه خوک و پيوند آن به موش نتيجه گرفتند که پس از دو فرآيند انجماد و پيوند، بافت اسپرماتوژنزيس طبيعي خود را از سرگرفته و اسپرماتيد طويل حاصل مي شود (32).
4-1-4-کشت
مطالعات کشت آزمايشگاهي بافت بيضه که از يک سده ي پيش آغاز شده است، پايه اي جهت مطالعهي فرآيند اسپرماتوژنزيس در آزمايشگاه ايجاد کرده است. در سال هاي اخير به منظور بررسي اثرات انجماد بر روي بافت بيضه از کشت Insert استفاده شده است (23). Sato و همکاران در سال 2011 کشت بافت بيضه بر روي آگار را به عنوان روشي مناسبي براي تکميل فرآيند اسپرماتوژنزيس در شرايط آزمايشگاهي معرفي کردند و توانستند با تزريق درون سيتوپلاسمي8 اسپرم هاي حاصل از اين روش، نوزادان موش سالم و بارور توليد کنند.
وجود سرم در محيط کشت براي رشد و تکوين بافت بيضه اهميت دارد و عدم وجود سرم در محيط کشت مانع تقسيم سلولي و رشد قطري لوله هاي سمي نفروس مي شود. کشت بافت بيضه در محيط کشت حاوي سرم و در دماي 34 درجه ي سانتيگراد به عنوان روشي مناسب براي کشت است (44). در مقايسه بين عوامل تغذيه کننده ي بافت بيضه در محيط کشت، 9KOSR در مقايسه با FBS10باعث افزايش شدت اسپرماتوژنزيس و افزايش طول مدت زماني که بافت توانايي اسپرماتوژنزيس را دارد مي شود. محيط هاي کشت 11RPMI و ?-MEM12 باعث تکوين بهتر بافت بيضه ي کشت داده شده مي شوند (44). افزايش غلظت سرم، افزودن هورمون ها و عوامل مختلف به محيط کشت موجب بهبود کيفيت تکوين بافت بيضه نمي شود، چه بسا ممکن است اثرات مخربي نيز در تکوين بافت بيضه داشته باشد (44). Sato و همکارانش در ادامه ي مطالعاتشان در سال 2013 با کشت موفقيت آميز بافت بيضه ي موش نابالغ منجمد شده با روش هاي انجماد آهسته و شيشه اي بر روي آگار توانستند به اسپرماتيد گرد و اسپرم بالغ دست پيدا کنند و از طريق تزريق درون سيتوپلاسمي اسپرم و تزريق اسپرماتيد گرد در تخمک13 توانستند به نوزاد سالم دست يابند (45).
1-5-تغييرات ملکولي متاثر از انجماد
انجماد تکنيکي است که به صورت گسترده و از چندين دهه ي پيش در روش هاي کمک باروري مورد استفاده قرار گرفته است. مطالعات اخير نشان مي دهند که تکنيک هاي انجمادي باعث ايجاد تغييرات ملکولي مانند شکست DNA، حذف، اضافه شدن يا تغيير در بازهاي آلي و ايجاد کراس لينک در ساختار DNA سلول در سطوح مختلف چرخه ي سلولي مانند M ,G2 ,S ,G1 مي شود. از سوي ديگر آسيب DNA در اسپرم موجب باروري ضعيف، اختلال در تکوين جنين، افزايش نرخ سقط و همچنين ايجاد بيماري در نوزادان مي شود(46). انجماد علاوه بر آسيبي که به DNA وارد مي کند باعث کاهش و يا حذف رونوشت برخي از ژن هاي مهم در اسپرم مي گردد که براي لقاح و تکوين جنين حايز اهميت هستند (47). همچنين مشاهده شده که انجماد تيغه ي تناسلي ماهي گورخري14 موجب ايجاد تغييرات نامطلوب در سلول ها و تغييرات ژنتيکي و اپي ژنتيکي در ژن هاي مرتبط با تکوين و تمايز سلول ها مي شود (48). مطالعات نشان مي دهد انجماد (آهسته و شيشه اي) و پيوند بافت بيضه در انسان سبب تغيير در بيان ژن هاي MAGE-A415 (ژن مبين سلول هاي زايا)، 3?-HSD16 (شاخص سلول هاي لايديک) در سطح پروتئين مي شود، ولي در بيان ژن Ki67 (ژن مرتبط با تکثير سلولي) تغييري ايجاد نمي کند (40). همچنين کشت کوتاه مدت بافت بيضه ي موش نابالغ پس از انجماد (آهسته و شيشه اي) افزايش ميزان بيان ژن Ki67 در سطح پروتئين را نشان داد (23). درتحقيقي که در سال 2007 انجام شد، تغييري در بيان ژن ويمنتين (از جمله پروتيين هاي اسکلت سلولي) و CD34 (ازجمله پروتيين هايي که در اتصال سلول ها نقش دارند) در سطح پروتيين پس از انجماد و ذوب بافت بيضه انسان در مقايسه با گروه کنترل مشاهده نشد ولي بيان ژن MAGE-A4 پس از انجماد کاهش داشت (49). اينگونه به نظر مي رسد که تغييرات مذکور در بيان پروتئين هاي مختلف پس از انجماد، پيوند و کشت بافت بيضه با تغييرات ژنتيکي و اپي ژنتيکي در سطح ژن مرتبط باشد.
1-5-1-آپوپتوزيس17
مرگ سلولي توسط مسير هاي مجزا در حين فرآيند آپوپتوز با تغييرات بيوشيميايي مانند فعال شدن کاسپازهاي آغازگر و اجرايي، آزاد شدن سيتوکروم c، قرارگيري مانند نکروز18، آپوپتوز (50) و اتوفاژي19(51) اتفاق مي افتد. آپوپتوز مرگ سلولي است که به واسطه ي تغييرات مورفولوژيک مانند چروکيدگي غشا سلول، متراکم شدن کروماتين، از بين رفتن يکپارچگي غشا هسته، ايجاد حباب در سلول20 و تشکيل اجسام آپوپتوزي21 قابل تشخيص است (52). تغييرات مورفولوژيک فسفاتيديل سرين در نيم لايه ي خارجي، شکست و غيرفعال شدن 22PARP و تشکيل قطعات اينترانوکلئوزمال23 همراه است (53). لزوما تمامي وقايع ذکر شده در تمامي رده هاي سلولي مشاهده نمي شود و با توجه به نوع رده ي سلولي فقط تعدادي از اين اتفاقات در حين آپوپتوز مشاهده مي شود. دوره ي زماني بروز حوادث بيوشيميايي آپوپتوز نيز به عوامل مختلف مانند نوع سلول يا بافت، غلظت مواد مورد استفاده براي تيمار و زمان قرارگيري در برابر عوامل القاگر آپوپتوز که در تيمار سلول يا بافت استفاده شده است بستگي دارد (54, 55). دو مسير عمده که باعث پيشبرد آپوپتوز مي شوند عبارتند از: مسير خارجي يا غشايي24 و مسير داخلي يا ميتوکندريايي25. هر يک از مسيرهاي ذکر شده توانايي اثر گذاري و فعال سازي مسير ديگر را دارند. در بافت بيضه نيز بدليل تقسيمات متوالي ميوز و ميتوز احتمال ايجاد سلولهاي ناکارآمد از لحظ ژنتيکي بسيار زياد است و فرآيند آپوپتوز در بافت بيضه باعث از بين رفتن چنين سلولهايي مي شود (56).
1-5-1-1 مسير خارجي آپوپتوز و ژن هاي دخيل در آن
فعال سازي مسير خارجي در نتيجه ي اتصال عامل مرگ(CD95, Fas ligand, …) به گيرنده مرگ(Fas, …) است. ابتدا عامل مرگ به گيرنده ي مرگ متصل شده و با سه تايي شدن26 گيرنده ي مرگ و فعال سازي کاسپاز 8 مسير غشايي آپوپتوز آغاز مي شود. کاسپاز 8 مي تواند به شکل غيرمستقيم و با شکستن و فعال سازي پروتيين Bid باعث رخداد آپوپتوز از طريق مسير ميتوکندريايي شود. کاسپاز 8 فعال سبب فعال شدن کاسپاز 3 و7 مي شود که نتيجه ي آن فعال شدن و غيرفعال شدن پروتئين هاي هدف در داخل سلول است (شکل 1-1).
در سال 2010 اثرات انجماد در بيان ژن هاي آپوپتوزي Fas/Fas ligand بررسي شد، در اين آزمايش ارزيابي هاي ايمونوهيستوشيمي براي بررسي بيان اين دو ژن حاکي از عدم بيان ژنها پيش از انجماد و بيان اين ژنها پس از انجماد در فوليکولهاي بدوي تخمدان با ظاهر سالم بود (57).


پاسخ دهید