2-4. بررسي داروي مورد مطالعه36
2-4-1. فارماكوكنتيك دارو36
2-4-2. مكانيسم اثر دارو37
2-4-3. موارد مصرف دارو37
2-4-4. دوز مصرفي دارو38
2-4-5. موارد منع مصرف و احتياط39
2-4-6. عوارض جانبي39
2-4-7. تداخلات40
2-4-8. اشكال دارويي41
2-4-9. خصوصيات فيزيكي دارو41
2-5. اهميت اندازه‌گيري آريپيپرازول42
2-6. اهداف42
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1. مواد شيميايي و تجهيزات دستگاهي44
3-1-1. مواد شيميايي، استانداردها و نمونه‌هاي حقيقي44
3-1-2. تجهيزات دستگاهي44
3-2. روش استخراج45
3-2-1. استخراج به اختصار طي مراحل زير انجام گرفت45
3-2-2. مراحل بهينه‌سازي47
3-2-2-1. بهينه‌سازي شرايط جداسازي47
3-2-2-2. بهينه‌سازي شرايط استخراج47
3-2-2-2-1. نوع حلال آلي47
3-2-2-2-2. اثر pH فاز دهنده47
3-2-2-2-3. اثر pH فاز گيرنده47
3-2-2-2-4. اثر قدرت يوني فاز دهنده48
3-2-2-2-5. اثر همزدن محلول آناليت48
3-2-2-2-6. اثر زمان استخراج48
3-2-2-2-7. اثر دما48
3-2-3. ارزيابي كارآيي روش استخراج48
3-2-3-1. منحني درجه‌بندي48
3-2-3-2. تعيين فاكتور پيش تغليظ (PF)49
3-2-3-3. تعيين تكرارپذيري (RSD)49
3-2-4. آناليز نمونه حقيقي49
فصل چهارم: نتايج
4-1. ميكرواستخراج سه فازي بر پايه استفاده از فيبر توخالي متخلخل51
4-1-1. اصول تئوري51
4-2. مراحل بهينه‌سازي54
4-2-1. بهينه‌سازي شرايط جداسازي54
4-2-2. بهينه‌سازي شرايط استخراج55
4-2-2-1. نوع حلال آلي55
4-2-2-2. اثر pH فاز گيرنده و فاز دهنده56
4-2-2-3. اثر سرعت همزدن محلول آناليت58
4-2-2-4. اثر قدرت يوني فاز دهنده59
4-2-2-5. اثر زمان استخراج61
4-2-2-6. اثر دما61
4-3. تعيين پارامترهاي تجزيه‌اي روش استخراج63
4-3-1. تهيه‌ي منحني درجه‌بندي63
4-3-2. فاكتور پيش تغليظ (PF)64
4-3-3. تعيين حد تشخيص (LOD)65
4-3-4. تكرارپذيري روش (RSD)66
4-4. آناليز نمونه حقيقي66
فصل پنجم: بحث و نتيجه‌گيري
5-1. مقايسه روش استخراجي با روش‌هاي گزارش شده ديگر مراجع71
5-2. نتيجه‌گيري73
خلاصه انگليسي76
منابع77
ضمائم88
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 2-1. كاربردهاي كروماتوگرافي تقسيمي24
جدول 2-2. كاربردهاي اخير HF-LPME در استخراج گونه‌هاي مختلف33
جدول 4-1. خلاصه نتايج بهينه‌سازي استخراج62
جدول 4-2. ارقام شايستگي HF-LPME داروي آريپيپرازول66
جدول 4-3. نتايج اندازه‌گيري آريپيپرازول در ادرار و پلاسما69
جدول 5-1. كارهاي ديگر انجام شده بر روي آريپيپرازول71
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1. بررسي نوع حلال پر كننده منافذ فيبر56
نمودار 4-2. بررسي اثر تغييرات pH فاز دهنده در فرآيند استخراج 57
نمودار 4-3. بررسي اثر تغييرات pH فاز گيرنده در فرآيند استخراج 58
نمودار 4-4. اثر سرعت همزدن بر فرآيند استخراج 59
نمودار 4-5. تاثير قدرت يوني فاز دهنده بر فرآيند استخراج60
نمودار 4-6. تاثير زمان بر فرآيند استخراج61
نمودار 4-7. تاثير دما بر فرآيند استخراج62
نمودار 4-8. منحني درجه‌بندي مستقيم63
نمودار 4-9. منحني درجه‌بندي بعد از استخراج با هالوفايبر 64
نمودار 4-10. منحني درجه‌بندي بعد از استخراج با هالوفايبر جهت بررسي Linearity 64
فهرست اشكال
عنوان صفحه
شكل A. روش‌هاي مختلف استخراج و ميكرواستخراج3
شكل 2-1. نماي جانبي از سيستم ميكرواستخراج با حلال با استفاده از ميله‌ي تفلوني9
شكل 2-2. نمايي از سيستم ميكرواستخراج با تك قطره الف) استخراج مستقيم از درون محلول ب) استخراج از فضاي فوقاني11
شكل 2-3. اصول استخراج HF-LPME الف) دو فازي ب) سه فازي13
شكل 2-4. الف) سيستم HF-LPME براساس پيكربندي U شكل ب) پيكربندي ميله‌اي 16
شكل 2-5. طرح شماتيك از سيستم HF-LPME17
شكل 2-6. الف) شمايي از سيستم HF-LPME از حجم زياد و ب) سيستم نيمه خودكار18
شكل 2-7. طرح شماتيك ميكرواستخراج فاز مايع به روش الف) مستقيم و ب) فضاي فوقاني20
شكل 2-8. شمايي از يك دستگاه HPLC25
شكل 2-9. يك حلقه نمونه‌برداري كروماتوگرافي مايع28
شكل 2-10. سلول آشكارساز فرابنفش براي HPLC31
شكل 2-11. ساختار شيميايي آريپيپرازول36
شكل 3-1. نمايي از استخراج دارو به روش HF-LPME در آزمايشگاه46
شكل 4-1. كروماتوگرام تزريق محلول آبي آريپيپرازول در شرايط بهينه جداسازي55
شكل 4-2. الف) كروماتوگرام ادرار شاهد ب) كروماتوگرام نمونه ادراري ppm167
شكل 4-3. الف) كروماتوگرام پلاسما شاهد ب) كروماتوگرام نمونه پلاسما ppm5/0 ………………………..68

خلاصه فارسي
آريپيپرازول يک داروي ضد سايکوز آتيپيکال است که با ترکيبي از فعاليت آنتاگونيستي رسپتور 5-HT2A و پارشيال آگونيستي رسپتورهاي5-HT1A و D2 دوپامين اثر درماني خود را نشان مي‌دهد. اين دارو در درمان اسکيزوفرني، اختلالات دو قطبي تيپ I و به عنوان درمان کمکي در افسردگي ماژور استفاده مي‌شود.
در مواردي كه پاسخ مناسب از دارو ديده نشده، اندازه‌گيري سطوح پلاسمايي به منظور رساندن آن به مقادير لازم قبل از قطع دارو و جايگزين کردن ديگر داروهاي ضد سايکوز ضروري است. با توجه به اينکه سطح پلاسمايي آريپيپرازول به مقادير نانوگرم در ميلي‌ليتر مي‌رسد، لذا مي‌بايست از متدي استفاده کرد که قدرت شناسايي و تفکيک اين دارو را در اين غلظت کم داشته باشد.
در اين مطالعه يك روش ميكرواستخراج فاز مايع با استفاده از فيبر توخالي به همراه كروماتوگرافي مايع با عملكرد بالا (HPLC) و دتکتور UV جهت پيش تغليظ و شناسايي آريپيپرازول در پلاسما و ادرار به كار برده شد. آريپيپرازول از 15 ميلي‌ليتر محلول بازي نمونه با 8/8 :pH به داخل يك حلال آلي (اکتانول) كه در منافذ ديواره فيبر قرار داشت استخراج شد. به دنبال آن اين دارو از حلال آلي به داخل فاز گيرنده ي آب با ماهيت اسيدي كه در داخل فيبر قرار داشت وارد شد. در اين مطالعه فاكتورهاي موثر در ميكرواستخراج شامل pH فاز دهنده و فاز گيرنده، نوع حلال آلي، قدرت يوني فاز دهنده، دماي فاز دهنده، زمان استخراج و سرعت هم‌زدن بررسي و بهينه شد.
پس از استخراج دارو با شرايط بهينه فاز دهنده با8/8:pH و فاز گيرنده با 4/2: pH، حلال آلي اکتانول، زمان استخراج 45 دقيقه، دماي فاز دهنده 40 درجه سانتيگراد، دور هم‌زن 625 و بدون اضافه کردن نمک، فاكتور پيش تغليظ 127 و حد تشخيص ng/ml 9/3 و انحراف معيار استاندارد در يك روز كاري %4/2 و انحراف استاندارد نسبي در چند روز كاري متوالي %9/3 حاصل شد.
مقدمه
علم شيمي تجزيه روش‌هاي متنوعي را براي آناليز كمي و كيفي مواد ارائه مي دهد. امروزه روش‌هاي جداسازي، تفكيك گونه‌اي موجود در بافت‌هاي پيچيده را با حد تشخيصي در حد خيلي كم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روش‌هاي جداسازي، مرحله‌ي آماده‌سازي نمونه نيز يكي از مهم‌ترين مراحل در روند تجزيه مي‌باشد. اين مرحله شامل تبديل بافت يك نمونه حقيقي به حالتي است كه براي تجزيه با يك تكنيك جداسازي و يا روش‌هاي ديگر مناسب باشد. مي‌توان گفت مرحله آماده‌سازي نمونه براي اهداف زير طراحي شده است:
1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزايش گزينش‌پذيري روش

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2- پيش تغليظ آناليت مورد نظر و افزايش غلظت آن به نحوي كه بتوان آنرا با دستگاه‌هاي تجزيه‌اي اندازه‌گيري كرد.
3- تبديل آناليت‌ها به فرمي كه براي شناسايي با دستگاه تجزيه‌اي مناسب باشد.
اساسي‌ترين روش آماده‌سازي نمونه، روش استخراج است. تلاش متخصصين شيمي تجزيه براي ابداع و توسعه‌ي روش‌هاي اندازه‌گيري با دقت و صحت بالا و نيز حذف مراحل دستي كه موجب تكرارپذيري پايين در روش‌هاي تجزيه‌اي مي‌شود، باعث شده كه روش‌هاي استخراجي نويني ابداع گردد. شكل (A) روش‌هاي مختلف استخراج و ميكرواستخراج را دسته‌بندي مي‌كند كه راجع به آنها توضيحات مفصلي در مراجع آمده است (1).
در كليات به اختصار راجع به ميكرواستخراج مايع- مايع با قطره و روش‌هاي استخراج بر پايه استفاده از فيبرهاي توخالي متخلخل بحث خواهد شد.
شكل (A). روش‌هاي مختلف استخراج و ميكرواستخراج
فصل اول
كليات
1-1. ضرورت و اهميت موضوع
آريپيپرازول يک داروي ضد سايکوز آتيپيکال است که با ترکيبي از فعاليت آنتاگونيستي رسپتور 5-HT2A و پارشيال آگونيستي رسپتورهاي5-HT1A و D2 دوپامين اثر درماني خود را نشان مي‌دهد. از طرفي با اثرات خود بر اين رسپتورها باعث بروز عوارض ناخواسته‌اي مثل افزايش قابل توجه وزن، آکاتيزي، ترمور، ديسکينزي تاخيري، عوارض اکستراپيراميدال، افت فشار خون وضعيتي، سندرم نورولپتيک بدخيم و … مي‌شود. سطح پلاسمايي اين دارو مي‌تواند ميان بيماران متفاوت باشد و در مواردي كه پاسخ مناسب از دارو ديده نشده، اندازه‌گيري سطوح پلاسمايي به منظور رساندن آن به مقادير لازم قبل از قطع دارو و جايگزين کردن ديگر داروهاي ضد سايکوز ضروري است. با توجه به اينکه سطح پلاسمايي آن به مقادير نانوگرم در ميلي‌ليتر مي‌رسد، لذا مي‌بايست از متدي استفاده کرد که قدرت شناسايي و تفکيک اين دارو را در اين غلظت کم داشته باشد. يکي از اين متدها استفاده از دستگاه LC-MASS مي‌باشد، ولي اين روش بسيار پرهزينه مي‌باشد. لذا هدف اين پايان‌نامه، ابداع روشي نوين با استفاده از فيبر توخالي مي‌باشد تا بتوان اين دارو را در مقادير بسيار کم تغليظ و سپس با دستگاهHPLC ساده با دتکتور UV اندازه‌گيري نمود.
1-2. بيان مساله
جهت اندازه‌گيري مقادير Trace آريپيپرازول در مايعات بدن مي‌بايست از متدي استفاده شود كه به تيم پزشكي در تنظيم دوز دارو بدون نياز به خون‌گيري و از طريق غير تهاجمي كمك كند و قدرت شناسايي و تفكيك اين دارو را داشته باشد. با استفاده از متد پيش تغليظ دارو با ميكرواستخراج فاز مايع به كمك هالوفايبر مي‌توان مقادير بسيار كم اين دارو را در پلاسما و ادرار تغليظ و استخراج نمود، سپس با دستگاه HPLC اندازه‌گيري كرد. از آنجا كه دفع اين دارو عمدتاً از طريق مدفوع است و با توجه به نيمه ي عمر آن، مي‌توان از نمونه ي پلاسما افراد جهت آناليز استفاده نمود. اين روش بسيار جديد بوده و تا به حال جهت پيش تغليظ و اندازه‌گيري اين دارو استفاده نشده است.
1-3. اهداف
1- ارائه يك روش استخراجي ساده و كارآمد با دقت بالا
2- ارائه يك روش سريع و حساس براي اندازه‌گيري دارو در مايعات بيولوژيک
فصل دوم
بررسي متون و مطالعات ديگران در اين زمينه
2-1. مروري بر روش‌هاي استخراج مايع- مايع و ميكرواستخراج مايع- مايع1
استخراج مايع- مايع بر مبناي توزيع گونه بين دو فاز امتزاج‌ناپذير كه معمولاً يكي از آن‌ها آب و ديگري يك حلال آلي است، استوار است. در اين روش، اساس جداسازي توزيع است (2 و 1).
عوامل موثر در استخراج مايع- مايع عبارتند از:
نوع حلال استخراج كننده، حجم حلال آلي براي استخراج، pH، عامل استخراج، عامل پوشاننده و قدرت يوني محيط.
استخراج مايع- مايع يكي از قديمي‌ترين روش‌هاي جداسازي است که سادگي و كاربردي بودن در مقياس تجزيه‌اي و صنعتي از عوامل بقاي اين روش تا امروزه بوده است. از مهم‌ترين معايب اين روش مصرف زياد حلال آلي و آلودگي محيط زيست، هزينه حلال آلي و ايجاد سميت مي‌باشد. در همين راستا با پيشرفتي كه در اين روش صورت گرفت و با كم كردن مقدار حلال آلي استخراجي، روش‌هاي ميكرواستخراج با حلال روي كار آمدند كه در اين روش‌ها حجم حلال آلي مصرفي به مقدار قابل توجهي كاهش مي‌يابد (3).
روش‌هاي ميكرواستخراج با حلال شامل موارد زير مي‌باشد:
1- ميكرواستخراج فاز مايع با تك قطره 2(SDME)
2- ميكرواستخراج فاز مايع توسط غشاي فيبر توخالي 3(HF-LPME)
3- ميكرواستخراج فاز مايع با استفاده از انجماد حلال استخراج كننده
4- ميكرواستخراج فاز مايع- مايع پخشي4(DLPME)
2-1-1. ميكرواستخراج فاز مايع
2-1-1-1. ميكرواستخراج فاز مايع با تك قطره
Liu و Dasgupta اولين محققاني بودند كه از يك قطره‌ي كوچك جهت تغليظ و استخراج استفاده نمودند. آنها با به كار بردن يك ميكرو قطره‌ي آلي از جنس كلروفرم به صورت معلق در يك قطره آبي در حال جريان (سيستم قطره در قطره) توانستند سديم دو دسيل سولفات را به صورت زوج يون با متيلن بلو به داخل كلروفرم استخراج نمايد (4). تقريباً در همان زمان jeannot و cantwell روشي را معرفي كردند كه آن را ميكرواستخراج با حلال ناميدند (5). در اين روش يك قطره 8 ميكروليتري از حلال آلي n- اكتان حاوي مقدار ثابتي از استاندارد داخلي در انتهاي ميله‌ي تفلوني قرار مي‌گرفت و ميله‌ي تفلوني به محلول آبي در حال چرخش كه حاوي آناليت بود وارد مي‌شد. بعد از اتمام استخراج، ميله تفلوني از محلول آبي بيرون كشيده شده و 1 از فاز آلي براي آناليز به دستگاه كروماتوگرافي گازي تزريق مي‌گرديد (شكل 2-1).
شكل (2-1). نماي جانبي از سيستم ميكرواستخراج با حلال با استفاده از ميله‌ي تفلوني
در سال 1997 به موازات تحقيقات jeannot و cantwell روي ميكرواستخراج با قطره He (6) و Lee استخراج با قطره را در حالت استاتيك و ديناميك انجام دادند. در روش استاتيك، يك ميكروليتر از قطره‌ي استخراجي در نوك سوزن ميكروسرنگ معلق شده، در تماس با محلول آبي قرار گرفته و استخراج گونه از فاز آبي به داخل قطره انجام مي‌گيرد. در روش ديناميك، پيستون ميكروسرنگ به صورت قيف جدا كننده عمل مي‌نمايد. با كشيدن پيستون و ورود محلول آبي به داخل ميكروسرنگ، لايه‌ي نازكي از فاز آلي در جدار داخلي سرنگ و سوزن تشكيل شده و همرفت القاء شده در اثر حركت پيستون منجر به استخراج گونه‌ها از فاز آبي به لايه آلي مي‌گردد (7). ميكرواستخراج با قطره به دو شيوه دو فازي و سه فازي قابل انجام است. در ميكرواستخراج دو فازي، استخراج گونه‌ها به درون يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب رخ مي‌دهد. در ميكرواستخراج سه فازي يا ميكرواستخراج مايع- مايع- مايع5، گونه‌ها از نمونه به درون حلال آلي و سپس با استخراج برگشتي به درون فاز آبي پذيرنده استخراج مي‌شوند.
در ميكرواستخراج با قطره (دو فازي يا سه فازي) به دليل انتقال گونه‌ها از نمونه‌هاي با حجم چند ميلي‌ليتر به داخل ميكرو قطره‌اي با حجم ميكروليتر، فاكتور تغليظ بالايي براي مواد مختلف به دست مي‌آيد. وجود يك مرحله استخراج برگشتي در سيستم سه فازي، انتخابگري سيستم را بالا مي‌برد، چرا كه طي آن بسياري از مولكول‌هاي خنثي حذف گرديده و روش از قدرت پاكسازي6 بالايي براي نمونه‌هاي با ماتريس پيچيده برخوردار مي‌گردد. با انتخاب حلال آلي مناسب، كاهش نسبت حجم ميكرو قطره‌ي پذيرنده به نمونه، تنظيم شرايط و pH فازهاي دهنده و گيرنده و نيز با بكارگيري واكنش‌گرهاي كمكي در فاز استخراجي به منظور به دام اندازي گونه‌ها، مي‌توان كارايي استخراج را افزايش داد (8).
قرارگيري حلال استخراجي در معرض بافت پيچيده‌ي نمونه و انحلال جزيي حلال در آب، دشواري نگهداري قطره درون محلول، عدم امكان استفاده از دماهاي بالا و ناپايدار شدن قطره طي هم‌زدن محلول، همچنين كشيده شدن مقداري از محلول همراه با قطره به درون ميكروسرنگ در انتهاي كار از جمله معايب روش SDME مي‌باشد. Jeannot و همكارانش در سال 2001 با هدف رفع اين محدوديت‌ها ايده‌ي استفاده از قطره‌ي حلال در فضاي فوقاني7 را مطرح نمودند (9).
در اين روش كه ميكرواستخراج با حلال از فضاي فوقاني ناميده مي‌شود، قطره براي زماني معلوم در تماس با فضاي فوقاني نمونه قرار گرفته و استخراج گونه‌ها از محلول به فضاي فوقاني و از آنجا به درون قطره انجام مي‌پذيرد.
“HS-SDME” روشي ساده، حساس و ارزان است و جهت استخراج تركيبات فرار و نيمه فرار از نمونه‌هاي با بافت پيچيده بسيار مناسب مي‌باشد (11، 10) به منظور افزايش تكرارپذيري استخراج، اين روش توسط دستگاه‌هاي نيمه خودكار و تمام خودكار نيز انجام پذيرفته است. در شكل (2-2) نمايي از سيستم ميكرواستخراج با قطره به دو شيوه استخراج مستقيم و استخراج از فضاي فوقاني نشان داده شده است.
(شكل 2-2). نمايي از سيستم ميكرواستخراج با تك قطره الف) استخراج مستقيم از درون محلول ب) استخراج از فضاي فوقاني
2-1-1-2. ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي (HF-LPME)
روش LPME با تك قطره به صورت دو فازي و سه فازي از مزايايي همچون مصرف مقادير بسيار كم از نمونه و حلال آلي، حساسيت و فاكتور تغليظ بالا، قابليت انجام به صورت استاتيك و ديناميك و قدرت پاكسازي بسيار مطلوب براي نمونه‌هاي پيچيده برخوردار است.
مهم‌ترين عيب روش از آنجا ناشي مي‌شود كه نگه‌داري قطره‌ي استخراجي در انتهاي ميكروسرنگ بويژه براي زمان‌هاي طولاني و تحت هم‌زدن شديد محلول دشوار بوده و به شرايط و مهارت خاصي نيازمند است. به منظور غلبه بر مشكلات فوق و نيز استفاده از فازهاي گيرنده‌اي با حجم بيشتر Rasmussen و Pedersen-Bjergaard در سال 1999 استفاده از فيبرهاي توخالي متخلخل از جنس پلي‌پروپيلن را به عنوان نگهدارنده‌اي جهت حفظ مكانيكي فاز استخراجي پيشنهاد نمودند كه تحت عنوان ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي نام گرفت(13، 12). در واقع تكنيك HF-LPME، نوعي روش ميكرواستخراج با غشاي مايع نگهداري شده مي‌باشد8 كه در آن حلال آلي توسط نيروهاي كاپيلاري درون منافذ فيبر قرار مي‌گيرد و لايه نازكي را نيز روي ديواره‌ي فيبر تشكيل مي‌دهد. فاز استخراجي كه در حد چند ميكروليتر مي‌باشد داخل مجراي دروني فيبر وارد مي‌گردد. حجم فاز آلي مورد استفاده در اين روش در قياس با روش سه فازي LPME با قطره كمتر بوده و از سويي امكان تشكيل امولسيون كه از مشكلات متداول روش LLE است، حذف مي‌گردد.
2-1-1-2-1. اصول استخراج و سيستم‌هاي مختلف در استفاده از HF-LPME (14)
شكل (2-3)، اصول روش ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي را نشان مي‌دهد. محلول آبي نمونه درون يك ظرف كوچك پر مي‌شود و تكه‌اي از يك فيبر توخالي از جنس پلي‌پروپيلن متخلخل درون نمونه قرار داده مي‌شود. حجم نمونه آلي معمولاً در حد چند ميلي‌ليتر و طول فيبر، بسته به نوع كاربرد، در حد چند سانتي‌متر است. پيش از استخراج، فيبر در يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب آغشته مي‌شود تا حلال، منافذ فيبر را پر كند. بدين ترتيب، لايه نازكي از حلال آلي در جداره‌ي فيبر، كه معمولاً 200 ميکرومتر ضخامت دارد، تشكيل مي‌شود. حجم كلي حلال آلي تثبيت شده در غشاء معمولاً 20-15 مي‌باشد. براي گونه‌هاي قابل يونيزاسيون، pH محلول به گونه‌اي تنظيم مي‌شود كه گونه‌ها به شكل غير يوني خود وجود داشته باشند تا حلاليت‌شان در نمونه آبي كم شود و قابليت استخراج‌پذيري آنها به درون حلال آلي افزايش يابد. بدين ترتيب، گونه‌هاي موجود در نمونه‌ي آبي از ميان فاز آلي تثبيت شده در غشاي فيبر به درون محلول گيرنده موجود در مجراي دروني فيبر استخراج مي‌شوند. براي تسريع اين فرآيند، هم‌زدن و چرخش سريع نمونه به كار گرفته مي‌شود. محلول گيرنده مي‌تواند از جنس همان حلال آلي تثبيت شده در منافذ غشاي فيبر باشد كه در اين صورت تشكيل يك سيستم دو فازي را مي‌دهد و گونه‌ها در يك فاز آلي استخراج مي‌شود (16، 15). ميكرواستخراج فاز مايع با سيستم دو فازي بيشتر براي گونه‌هايي به كار گرفته مي‌شود كه حلاليت‌شان در يك حلال آلي غير قابل امتزاج با آب به ميزان قابل توجهي بيشتر از محيط آبي است. در اين روش، فاز استخراجي مستقيماً با GC سازگار است، در حالي كه براي آناليز با HPLC يا CE9 به تبخير حلال و تركيب دوباره در محيط آبي نيازمند مي‌باشد.
شكل (2-3). اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازي (ب) سه فازي
در سيستم سه فازي، محلول گيرنده فاز آبي ديگري است كه در آن گونه موجود در نمونه آبي از طريق فيلم نازكي از حلال آلي در غشا به درون محلول آبي پذيرنده استخراج مي‌شود. اين شيوه استخراجي به گونه‌هاي بازي و اسيدي با گروه‌هاي عاملي يونيزه شونده محدود مي‌شود. براي استخراج تركيبات بازي، pH نمونه بايستي در ناحيه قليايي تنظيم شود تا از حلاليت آناليت جلوگيري كند. در حالي كه pH محلول گيرنده بايد پايين باشد تا اينكه حلاليت گونه در آن افزايش يابد. در اين صورت گونه‌ها به شكل خنثي وارد فاز آلي شده و مجدداً با تبديل به شكل يوني به فاز گيرنده، استخراج مي‌شوند. در مورد تركيبات اسيد pH فاز دهنده در ناحيه اسيدي و pH فاز گيرنده در ناحيه قليايي تنظيم مي‌شود. در نهايت فاز استخراجي مستقيماً مي‌تواند به دستگاه‌هاي CE، HPLC و يا LC-MS تزريق گردد.
ميكرواستخراج فاز مايع با فيبر توخالي به شكل ديناميك هم مي‌تواند انجام شود. در سيستم دو فازي، يك ميكروسرنگ با چند ميكروليتر از حلال آلي غير قابل امتزاج با آب پر مي‌شود (17). تكه كوچكي از فيبر توخالي به سوزن ميكروسرنگ متصل شده، فيبر توخالي براي چند ثانيه داخل حلال آلي گذاشته مي‌شود تا منافذ فيبر از حلال آلي پر شود. سپس سوزن سرنگ به همراه فيبر در نمونه آبي قرار داده مي‌شود و در طول استخراج، حجم‌هاي كوچكي از نمونه آبي به طور پي در پي به درون فيبر كشيده و خالي مي‌شود. در طي كشيدن نمونه آبي به درون سرنگ، فيلم نازك حلال آلي در جداره فيبر شديداً آناليت را از محلول نمونه استخراج مي‌كند، در حالي كه در طي بيرون راندن نمونه، اين فيلم نازك دوباره با فاز آلي درون سرنگ تركيب مي‌شود. در طول فرآيند تركيب شدن دوباره حلال، بخشي از گونه‌ي استخراج شده در طول چرخه، در حلال آلي داخل توده10 فيبر توخالي به دام مي‌افتد. پس از استخراج گونه‌ها طي چرخه‌هاي متوالي، بخشي از حلال آلي موجود در سرنگ براي آناليز به دستگاه كروماتوگرافي تزريق مي‌شود. سيستم سه فازي ديناميك نيز گزارش شده است كه البته مشابه روش دو فازي مي‌باشد. در اين روش، ابتدا ميكروسرنگ با چند ميكروليتر از محلول آبي پذيرنده و به دنبال آن با چند ميكروليتر از حلال آلي پر مي‌شود. مابقي فرآيند مشابه روش دو فازي مي‌باشد. “HF-LPME” ديناميك در مقايسه با سيستم‌هاي استاتيك سرعت استخراج را افزايش مي‌دهد، اما در عمل روش ديناميك پيچيده‌تر است و پارامترهاي تجربي بيشتري بايد كنترل و بهينه شوند (19، 18).
علاوه بر دو سيستم HF-LPME اشاره شده كه معمولاً براساس گراديان pH و يا انتقال توسط حامل مي‌باشد، اخيراً روش HF-LPME با اعمال يك ميدان الكتريكي در دو سمت غشا انجام گرفته و تحت عنوان جداسازي الكتريكي غشا11 نام گرفته است. در اين روش، نيروي محرك براي استخراج گونه‌ها اختلاف پتانسيل است و گراديان pH نقشي در استخراج ندارد (20).
در تحقيقاتي كه توسط Lee انجام گرفت، وي روش جديدي را بر مبناي فيبر توخالي به نام ميكرواستخراج سه فازي مايع- گاز- مايع12 ابداع نمود. در اين روش گونه‌ها در اثر حرارت از محلول به جداره فيبر پر شده با هوا نفوذ كرده و سپس به دليل pH خاص فاز گيرنده، در شكل يوني خود به درون فاز گيرنده استخراج مي‌شوند. مزيت اين روش اين است كه هيچ گونه حلال آلي در آن استفاده نمي‌شود.

2-1-1-2-2. جنبه‌هاي عملي و پيكربندي‌هاي مختلف HF-LPME
تا كنون اغلب كاربردهاي HF-LPME بر اساس فيبرهاي پلي‌پروپيلن بوده است، ولي استفاده از فيبر متخلخل پلي‌وينيليدين دي‌فلوئورايد13 هم گزارش شده است. دليل اين امر، سازگاري بيشتر پلي‌پروپيلن با گستره وسيعي از حلال‌هاي آلي بوده است. به علاوه، پلي‌پروپيلن با اندازه‌ي منافذ تقريباً 2/0به خوبي مي‌تواند حلال‌هاي آلي را در فيبر طي فرآيند LPME تثبيت كند، كه اين موضوع براي جلوگيري از نشت حلال به درون نمونه مهم مي‌باشد. اين مساله مخصوصاً در مورد محلول‌هايي كه به شدت هم‌زده مي‌شوند و نمونه‌هايي مانند پلاسما كه با حلال تشكيل امولسيون مي‌دهند، داراي اهميت است. قطر دروني فيبرهاي مورد استفاده معمولاً در محدوده 1200-600 مي‌باشد، ولي گزارشاتي نيز در زمينه استفاده از فيبرهاي توخالي با قطر دروني كمتر، تا حد 280 وجود دارد. در گزينش فيبر بايد ضخامت ديواره آن زياد نباشد تا فاصله انتشار در فيبر كوتاه بوده و سرعت استخراج افزايش يابد. فيبرهاي با ضخامت ديواره‌ي خيلي كم، استحكام فيزيكي كافي ندارند و در مقابل، استفاده از فيبرهاي با ضخامت بيشتر نيز به دليل افزايش حجم و ضخامت لايه‌ي آلي، منجر به زمان‌هاي استخراج طولاني‌تر و كاهش كارايي سيستم مي‌شود. از اين رو معمولاً ضخامت ديواره‌ي 200 براي اين منظور مناسب است. در اكثر موارد از فيبري با جنس پلي‌پروپيلن با قطر دروني 600، ضخامت ديواره‌ي 200 و اندازه منافذ 2/0 استفاده مي‌شود (18، 12).
در كار عملي با فيبر توخالي پيكربندي‌هاي14 مختلفي از HF-LPME به كار مي‌رود. اولين كار در زمينه ميكرواستخراج با فيبر توخالي با پيكربندي فيبر به صورت U شكل، توسط Rasmussen و Pedersen-Bjergaard معرفي گرديد (12). در اين تحقيق، قطعات 5/8 سانتي‌متر از فيبر توخالي پلي‌پروپيلني با قطر داخلي 600، ضخامت ديواره‌ي 200 و اندازه منافذ 2/0 براي استخراج بريده و استفاده شده‌اند. هر انتهاي فيبر به يك سوزن ميكروسرنگ متصل شد كه يكي از اين سرنگ‌ها براي ورود فاز گيرنده و ديگري براي كشيدن فاز گيرنده در انتهاي استخراج به كار گرفته شد. براي خروج فاز گيرنده يك فشار فوقاني كوچك روي سوزن اول اعمال مي‌شود و جمع‌آوري فاز گيرنده از لوله خروجي صورت مي‌گيرد (12). در پيكربندي U شكل كارايي استخراج مناسب است، ولي در مقابل روش انتقال فاز گيرنده و خودكار كردن15 سيستم مشكل مي‌باشد (12). براي رفع اين مشكل، پيكربندي ميله‌اي توسط Rasmussen و Pedersen-Bjergaard و سپس Andrews, Kramer (21) پيشنهاد گرديد. شكل (2-4) پيكربندي U شكل و ميله‌اي را نشان مي‌دهد. در پيكربندي ميله‌اي به منظور تسهيل در ورود و خروج ميكروسرنگ، قطعه‌اي مخروطي به نوك فيبر متصل مي‌شود كه امكان ورود و خروج فاز استخراجي را توسط ميكروسرنگ ساده‌تر مي‌سازد. اين تكنيك قابليت سازگاري بيشتري با نمونه‌برداري خودكار دارا مي‌باشد.
شكل (2-4). (الف) سيستم HF-LPME براساس پيكربندي U شكل (12) (ب) پيكربندي ميله‌اي (22)
به دنبال آن، تكنيك ديگري توسط Muller و همكارانش ارائه شد كه در اين تكنيك به يك انتهاي فيبر وسيله‌اي قيف مانند از جنس فولاد زنگ نزن متصل مي‌شود كه محل تزريق است. يك پيچ كوچك در محل تزريق براي نگهداري انتهاي باز فيبر به كار گرفته مي‌شود و تنها از يك ميكروسرنگ براي ورود و خروج فاز گيرنده استفاده مي‌شود. باز بودن بخش انتهايي فيبر، مشكلاتي مانند ايجاد حباب هوا طي كشيدن فاز گيرنده را رفع مي‌كند. در پايان، پس از استخراج، يك نمونه‌بردار خودكار مي‌تواند فاز استخراجي را به دستگاه GC تزريق كند.
اخيراً پيكربندي ساده‌تري ارائه گرديده كه شامل اتصال مستقيم فيبر به نوك سوزن ميكروسرنگ مي‌باشد (2-5). در اين تكنيك، طول مشخصي از فيبر پس از بسته شدن انتهاي آن با حرارت، به سوزن ميكروسرنگ كه حاوي محلول استخراجي است، متصل شده و پس از آغشته نمودن جدار فيبر با حلال آلي و تزريق محلول استخراجي به داخل فيبر، محلول استخراج كننده به داخل ميكروسرنگ كشيده و سپس به دستگاه كروماتوگرافي تزريق مي‌شود. شماي اين سيستم در شكل (2-5) نشان داده شده است.
شكل (2-5). طرح شماتيك از سيستم HF-LPME
اين پيكربندي بدون بستن انتهاي فيبر جهت انجام استخراج به صورت ديناميك به كار گرفته شده كه در آن يك پمپ سرنگي به طور خودكار، پيستون ميكروسرنگ را بالا و پايين مي‌كشد تا استخراج انجام شود (15).
قابل ذكر است كه كاربرد فيبر توخالي براي استخراج از حجم زيادي از نمونه در حد 1 ليتر (180) و نيز كاربرد آن به صورت نيمه خودكار نيز عملي شده است، به طوري كه در آنها يك يا دو مرحله‌ي استخراج مي‌تواند به صورت خودكار انجام گيرد. شكل (2-6) استخراج از حجم بالاي نمونه و همچنين سيستم نيمه خودكار استخراجي را نشان مي‌دهد.
شكل (2-6). (الف) شمايي از سيستم HF-LPME از حجم زياد و (ب) سيستم نيمه خودكار
با پيشرفت‌هاي سريع در اين زمينه pawliszyn و همكارانش در سال 2006 موفق به معرفي سيستم تمام خودكار HF-LPME شدند.
2-1-1-2-3. ميكرواستخراج فاز مايع از فضاي فوقاني با فيبر توخالي
نمونه‌برداري از فضاي فوقاني روش موفقي براي استخراج تركيبات فرار و نيمه فرار از نمونه‌هاي پيچيده است، به طوري كه در آن گونه‌ها ابتدا از نمونه جامد يا مايع خود به فضاي فوقاني نمونه انتقال مي‌يابند، سپس نمونه‌برداري و اندازه‌گيري انجام مي‌گيرد. بديهي است كه گونه‌هايي به اين روش قابل اندازه‌گيري هستند كه فراريت لازم جهت انتقال به فضاي فوقاني را داشته باشند. روش‌هاي نمونه‌برداري از فضاي فوقاني داراي حساسيت كمي هستند، مگر اينكه روش‌هاي مختلف ميكرواستخراج از فضاي فوقاني انجام گيرد. در اين روش‌ها گونه‌هاي خارج شده از بافت نمونه، ابتدا به فضاي فوقاني نمونه وارد و سپس توسط يك فاز استخراجي جذب و تغليظ مي‌شوند. در نهايت گونه‌ها به دستگاه اندازه‌گيري تزريق مي‌شوند. تغليظ انجام شده باعث دستيابي به حساسيت‌هاي بالا شده و اندازه‌گيري مقادير بسيار كم گونه‌هاي مختلف را امكان‌پذير مي‌سازد.


پاسخ دهید